IDENTIFICATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF MICROORGANISMS ISOLATED FROM HEALTHY PIGS IN THE REPUBLIC OF ARMENIA

По мере углубления знаний о взаимодействии микро и макромира стали накапливаться данные о неблагоприятных последствиях широкого и зачастую бесконтрольного применения кормовых форм антибиотиков, что продолжается до настоящего времени и в Республике Армения. В результате резко возросло число аллергических и токсических реакций у человека в связи с накоплением многих кормовых антибиотиков в продукциях животноводства и птицеводства; а также появились и стали распространяться устойчивые к антибиотикам микроорганизмы с увеличением числа множественных резистентных вариантов, что подтверждалось также результатами наших исследований. Кроме того, в настоящее время доказан факт циркуляции плазмид условно патогенных микроорганизмов от животных к человеку, и от человека к животным, что способствует быстрому распространению лекарственной резистентности  микроорганизмов во всем мире

При проведении микробиологических исследований важное место занимает выбор соответствующих питательных селективных сред, предназначенных для выращивания данного вида микроорганизма, результаты которых необходимы для идентификации, изучения ферментативных, морфо-тинкториальных свойств, а также определения устойчивости к антибиотикам 

Данная работа в нашей республике проводится впервые, имея в виду, что в медицинских и ветеринарных лабораториях исследование пищевых проб осуществляется только при наличии токсикоинфекции у людей при использовании продуктов животного происхождения. 

Цель исследования. Настоящая работа целенаправленна выделению из органов здоровых свиней микроорганизмов непосредственно при убое, изучению морфо-тинкториальных и биохимических свойств, а также определению степени антибиотикорезистентности в Республике Армения. Целью указанного метода отбора проб является исключение вероятности всех видов контактов в процессе завершение убоя и перевозки до пунктов продажи в магазинах или на рынках. 

Для выделения микроорганизмов из внутренних органов свиней использовали 87 проб (лимфатические узлы, печень, почки, сердце, кишечник) в стерильной таре с этикеткой, с обозначением всех необходимых данных. Бактериологические исследования проводились в соответствии с методами, указанными в книгах по ветеринарной микробиологии

После получения микробных ростов были приготовлены мазки и окрашены по методу Грама. По результатам исследований оценивали морфологические и тинкториальные  свойства выделенного штамма. Биохимические свойства оценивали способность ферментации ряда сахарных сред. 

Для определения присутствия энзим-каталазы у выделенных штаммов на предметное стекло наносили каплю 1%-ого раствора перекиси водорода и процесс появления пузырьков свидетельствует, что выделенный штамм производит фермент каталазу. При этом выбирали метод Api Staph-тест. При отрицательной реакции энтеробактерий выбирали Api-20E для идентификации данного микроба.

Следовательно, данные, полученные микробиологическими методами исследований, дают возможность точного определения выделенного штамма микроорганизма. В таблице и в наборе Api Staph-тесте представлены 19 видов реагента, из числа которых 12 – сахарные среды, а в наборе Api 20E из 19 реагентов сахарные среды составляли всего 9 видов. Результаты реакций сахарных сред указывают сахаролитические свойства выделенного штамма микроба. Чувствительность резистентности выделенных штаммов микроб к антибиотикам тестировали диско-диффузионным методом в соответствии с методическим указаниям МУК 4.2.1890-04

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, её концентрация должна составлять 1,5*10 КОЕ мл, которая при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду, которые были получены в готовом виде фабричного производства (МУК 4.2.1890-04).

Микробиологическими исследованиями 87 проб внутренних органов, взятых от здоровых свиней во время убоя, удалось выделить многие виды и подтипы стафилококков, салмонелл, коли-бактерий, энтеробактерий аэрогенес, протеи, энтерококков и других видов микроб, с использованием соответствующих селективных питательных сред. Во всех селективных средах имеются таблицы, где указаны какие виды микробов могут иметь рост с изменением окраски среды и колоний. Стафилококки очень хорошо растут на агаре манит-солевой, окраска среды из розового меняется на желтый. Важно то, что при первом же посеве из патматериала получены чистые культуры стафилококков. В мазках, окрашенных по Граму под микроскопом, были видны Грамположительные кокки, расположенные единичными формами, парами, а большинство – гроздьями, спор и капсул не образуют, неподвижны. В процессе работ неоднократно было установлено, что стафилококки росли также и на среде Симонса, цвет среды изменялся из зеленного на синий, и в приготовленных масках под микроскопом были хорошо видны только стафилококки, окрашенные по Граму положительно. После пересева на среду манит-агар получили жёлтые колони, а окраска среды изменялась из розового на желтый. В доступной нам литературе не были найдены подобные сообщения. Нами было установлено также, что стафилококки в основном выделяются из лимфатических узлов свиней, в единичных случаях – из печени. Все виды, выделенные нами энтеробактерий по Граму, были окрашены отрицательно, под микроскопом были видны небольшие палочки, с закругленными концами, споры и капсулы отсутствовали, обладали активной подвижностью. E. coli и Ent. aerogenes хорошо росли на агаре МакКонки, Салмонелла на агаре Симонса с цитратом окраска среды изменялась с зеленного на синий, а если окраска среды не меняется, то реакция считается отрицательной. При определении вида бактерий большое значение имеют также исследования биохимических свойств. Биохимическая активность выделенных из патматериалов бактерий чрезвычайно разнообразна и зависит от специфических ферментативные систем, содержащихся в клетке. Через 24 часа после постановки реакции регистрируем результаты, основываясь на изменении цвета каждого углевода.

В таблице 1 представлены три подтипа стафилококков и наименований сахаров. Ферментации сахаров обозначены знаком «+», а отсутствие ферментации данного подтипа – «-». Отсюда 5 штаммов St. aureus, 7 штаммов St. xylosus  и 4 штамма St.lentus из 12 видов сахара проявили 100% ферментацию. St. aureus раффинозу ферментировал из 5 штаммов – 1,  а ксилозу из 5 штаммов – 2. Отсутствие ферментации наблюдается в двух углеводах – ксилотол и мелибиоза. St. xylosus  из 7 штаммов не ферментировали ксилотол 3 штамма, мелибиозу – 3 штамма, рафинозу – 3 штамма. St.lentus из четырёх штаммов не ферментировали мелибиозу – 3, ксилозу – 3 и ксилотол – 1 штамм.

Как видно из таблицы 1, выделенные из патматериалов штаммы подтипов стафилококк не одинаково ферментируют все указанные углеводы, особенно ксилотол,  мелибиоз, рафиноз и ксилоз, при этом в одном случае штамм данного подтипа ферментирует все указанные углеводы, в другом – частично.

В таблице 2 представлены результаты сахаролитических свойств некоторых энтеробактерий. 

Из таблицы 2 видно, что 4 штамма Salmonella и 4 штамма E.coli из 9 углеводов ферментировали -6, а 3 штаммы Enterobacteria aerogenes из 9- и 7 углеводов. Указанные энтеробактерии не ферментировали уреазу, кроме 1 штамма Salmonella и E.coli. Все штаммы E.coli и Enterobacteria aerogenes не ферментировали инозитол, а Salmonella из 4 штамма – 1. Сахарозу ферментировали из 4-х 3 штамма Salmonella и E.coli.

В научной практике идентификацию выделенных из патматериалов микробных штаммов по Api тесту, типы и подтипы определяли соответствиями результатов морфологических, тинкториальных и биохимических свойств. Именно в основе Api теста лежит применение различных углеводов, результаты реакции которых оцениваются изменением цвета каждого углевода. При этом в конечном результате определяется «очень хорошая идентификация», «хорошая идентификация» данного выделенного микробного штамма. 

В таблице 3 представлены средние арифметические показатели выделенных микробных штаммов из органов здоровых свиней, полученные диско-диффузионного  методом. В таблице видно, что в графиках каждого штамма написаны три показателя – резистентность, умеренная резистентность и чувствительность, которые соответствуют размерам диаметра зон задержки роста микроба вокруг дисков антибиотиков. Учитывая многичисленность цифровых показателей, были выделены только высокие показатели резистентности и чувствительности данного штамма микроба к каждому антибиотику отдельно. Что касается низких показателей умеренной резистентности и чувствительности, то по всей вероятности, это связано с многократными использованиями данного антибиотика в виде кормовых добавок или инъекциями против возбудителей данной болезни, в результате которого, они в дальнейшем становятся более устойчивыми, а лечение – неэффективным. В последнее время на этот вопрос уделяют большое внимание, которое выражается в основном сокращением использования кормовых антибиотиков.     

Как видно из таблицы, St.aureus из 28 антибиотиков проявлял 100% чувствительность к 6-и, 80% к 6 антибиотикам. До 80% резистентность проявлял к 7-и антибиотикам. Низкие показатели чувствительности к остальным антибиотикам представлены в таблице.

St.xylosus из 28 антибиотиков имел 75-100% чувствительность только к 7 антибиотикам, а к 12 антибиотикам проявлял резистентность до 87,5%, а к остальным 9-и антибиотикам – умеренную резистентность. 

St.lentus имел большую разницу по сравнению с St. aureus и St.xylosus. При этом из 28 антибиотиков проявлял 100% чувствительность к 23 (82.10%) и только к 3 антибиотикам – 50% устойчивость. Это говорит о том, что подтип St.lentus сравнительно неустойчив к антибиотикам.

Следовательно, по результатам исследований можно заключить, что разные подтипы стафилококков, выделенные из органов здоровых свиней, не одинаково проявляют резистентность и чувствительность к многочисленным антибиотикам. Поэтому необходимо уделять внимание не только типам данного микроба, а также подтипам.

Энтеробактерий. E.coli – из 28 антибиотиков 100% чувствительность проявлял к 12 – и (42,9%) и 100% резистентность к 5-и (17,9%), а к 11 антибиотикам (39,5%) – сравнительно низкие показатели резистентности и чувствительности, то есть проявляли бактериостатистические действие.

Salmonella проявлял 100% чувствительность к 10-и антибиотикам (35,7%), а к 7-и антибиотикам 75% резистентность, а к остальным 11 антибиотикам (39,5%) – низкие и умеренные показатели резистентности и чувствительности, то есть проявляли бактериостатистические действие.

Ent.aerogenes из 28 антибиотиков проявлял 100% чувствительность к 11-и (39,3%) и 100% резистентность к 6-и  (21,4%), до 75% резистентность и чувствительность – к 11-антибиотикам (39,3%). В таблице видно, что против штамма Ent. aerogenes среди указанных антибиотиков проявляли низкие показатели резистентность и чувствительности, то есть бактериостатистические действие на микробных штаммов.                    

Основываясь на результатах исследований, можно констатировать, что в организме здоровых свиней существуют многие виды микроорганизмов и их подтипов, которые после выделения из органов во время убоя проявляли резистентность и чувствительность к 28 антибиотикам с выраженными разницами. При этом из указанных антибиотиков многие не имели бактериоцидных действий на выделенные штаммы микробов. Низкие показатели чувствительности возбудителя к антибиотикам могут быть обусловлены тем, что животных кормили обогащенными антибиотиками кормами.

Таким образом, обобщая результаты исследований, можно констатировать, что если выделенный возбудитель чувствителен (до 100%) к определенному количеству антибиотиков, тогда выражено бактерицидное действие, а при умеренной резистентности – с бактеристатическим действием. Последние блокируют репликацию и деление клеток, не вызывая их гибели. Клетки сохраняют способность к росту и при низкой резистентности организма возможен рецидив заболевания, а бактерицидное действие характеризуется гибелью клеток в присутствии антибиотика, относительно которых существуют также научные данные

Основываясь на результатах исследований, можно заключить, что в организме здоровых свиней существуют многие виды и подтипы микроорганизмов, которые проявляют резистентность и чувствительность к 28 антибиотикам с выраженными разницами. Некоторые подтипы выделенных микробов проявляют 100% резистентность к отдельным антибиотикам.

Из указанных антибиотиков многие не имели бактерицидного действия на разных подтипы микробов. Низкие показатели чувствительности выделенных возбудителей к отдельным антибиотикам могут являться результатом использования кормов, обогащенных этими антибиотиками.

На селективной питательной среде Агар-манит-солевой при первом же посеве из патматериала получена чистая культура стафилококков. Цвет среды из розового меняется на желтый, с ростом колоний желтого цвета. Стафилококки хорошо росли также на селективной среде «Агар Симонса с цитратом», цвет среды менялся из зеленного на синий, колонии-бесцветные, а в мазках были видны только стафилококки. После пересева на среде манит-агар, получили хороший рост колоний жёлтого цвета, с изменением цвета среды с розового на жёлтый, такие данные отсутствуют в литературе и в методиках этих сред.  

В процессе работ нами было установлено, что из всех исследованных внутренних органов свиней стафилококки выделялись из лимфатических узлов (в основном шейных) в 100%, в единичных случаях – из печени.

Установлено, что одни и те же подтипы стафилококков или энтеробактерий, выделенных из органов разных свиней, при определении идентификации и антибиотикорезистентности отличаются друг от друга, следовательно, при назначении антибиотиков в процессе лечения, необходимо проводить данные исследования.