IDENTIFICATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF MICROORGANISMS ISOLATED FROM HEALTHY PIGS IN THE REPUBLIC OF ARMENIA

Research article
DOI:
https://doi.org/10.23649/JAE.2023.37.6
Issue: № 9 (37), 2023
Suggested:
16.08.2023
Accepted:
01.09.2023
Published:
19.09.2023
422
4
XML
PDF

Abstract

In the course of examination of 87 samples of internal organs of healthy pigs, staphylococci, salmonellae, coli-bacteria, aerogenic microorganisms, olms and other microorganisms were isolated. Using the Api systems test for microbial identification, the type and subtype of these microbes were determined with a probability of up to 99.8%. Using 28 antibiotic discs, the resistance and sensitivity of the isolated strains were determined by disc diffusion method. The study showed marked sensitivity and resistance of the same strain to individual antibiotics (up to 100%). The results of biochemical and morphotinctural properties of the isolated strains helped to determine more precisely the type and subtype of the studied strains.

1. Введение

По мере углубления знаний о взаимодействии микро и макромира стали накапливаться данные о неблагоприятных последствиях широкого и зачастую бесконтрольного применения кормовых форм антибиотиков, что продолжается до настоящего времени и в Республике Армения. В результате резко возросло число аллергических и токсических реакций у человека в связи с накоплением многих кормовых антибиотиков в продукциях животноводства и птицеводства; а также появились и стали распространяться устойчивые к антибиотикам микроорганизмы с увеличением числа множественных резистентных вариантов, что подтверждалось также результатами наших исследований. Кроме того, в настоящее время доказан факт циркуляции плазмид условно патогенных микроорганизмов от животных к человеку, и от человека к животным, что способствует быстрому распространению лекарственной резистентности  микроорганизмов во всем мире

,
,
,
. Учитывая глобальную угрозу распространения антибиотикорезистентных штаммов в животноводстве и прямую связь этого явления с чрезмерным использованием антибиотиков, в некоторых странах сформулировали стратегию ограничительной политики применения антибиотиков при ряде инфекций как реальную меру сдерживания резистентности
,
,
.

При проведении микробиологических исследований важное место занимает выбор соответствующих питательных селективных сред, предназначенных для выращивания данного вида микроорганизма, результаты которых необходимы для идентификации, изучения ферментативных, морфо-тинкториальных свойств, а также определения устойчивости к антибиотикам 

,
.

Данная работа в нашей республике проводится впервые, имея в виду, что в медицинских и ветеринарных лабораториях исследование пищевых проб осуществляется только при наличии токсикоинфекции у людей при использовании продуктов животного происхождения. 

Цель исследования. Настоящая работа целенаправленна выделению из органов здоровых свиней микроорганизмов непосредственно при убое, изучению морфо-тинкториальных и биохимических свойств, а также определению степени антибиотикорезистентности в Республике Армения. Целью указанного метода отбора проб является исключение вероятности всех видов контактов в процессе завершение убоя и перевозки до пунктов продажи в магазинах или на рынках. 

2. Методы и принципы исследования

Для выделения микроорганизмов из внутренних органов свиней использовали 87 проб (лимфатические узлы, печень, почки, сердце, кишечник) в стерильной таре с этикеткой, с обозначением всех необходимых данных. Бактериологические исследования проводились в соответствии с методами, указанными в книгах по ветеринарной микробиологии

,
. Использовали селективные питательные среды производства «Condalo» фирма Франция; (агар-манит-солевой для выделения стафилококков, агар-висмут-сульфат для сальмонелл, агар-Симонса с цитратом для дифференциации энтеробактерий, агар-Макконки в основном для выделения колиформ и других энтеробактерий). Указанные среды были приготовлены в соответствии с методическими указаниями по нормативам Европейской фармакопеи.

После получения микробных ростов были приготовлены мазки и окрашены по методу Грама. По результатам исследований оценивали морфологические и тинкториальные  свойства выделенного штамма. Биохимические свойства оценивали способность ферментации ряда сахарных сред. 

Для определения присутствия энзим-каталазы у выделенных штаммов на предметное стекло наносили каплю 1%-ого раствора перекиси водорода и процесс появления пузырьков свидетельствует, что выделенный штамм производит фермент каталазу. При этом выбирали метод Api Staph-тест. При отрицательной реакции энтеробактерий выбирали Api-20E для идентификации данного микроба.

Следовательно, данные, полученные микробиологическими методами исследований, дают возможность точного определения выделенного штамма микроорганизма. В таблице и в наборе Api Staph-тесте представлены 19 видов реагента, из числа которых 12 – сахарные среды, а в наборе Api 20E из 19 реагентов сахарные среды составляли всего 9 видов. Результаты реакций сахарных сред указывают сахаролитические свойства выделенного штамма микроба. Чувствительность резистентности выделенных штаммов микроб к антибиотикам тестировали диско-диффузионным методом в соответствии с методическим указаниям МУК 4.2.1890-04

. В работе использовали агар Мюллера, предназначенный для постановки теста диско-диффузии и диски 28 антибиотиков итальянского производства. На этикетках каждого антибиотика написаны содержание в мкг, название и срок годности. 

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, её концентрация должна составлять 1,5*10 КОЕ мл, которая при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду, которые были получены в готовом виде фабричного производства (МУК 4.2.1890-04).

3. Основные результаты и обсуждение

Микробиологическими исследованиями 87 проб внутренних органов, взятых от здоровых свиней во время убоя, удалось выделить многие виды и подтипы стафилококков, салмонелл, коли-бактерий, энтеробактерий аэрогенес, протеи, энтерококков и других видов микроб, с использованием соответствующих селективных питательных сред. Во всех селективных средах имеются таблицы, где указаны какие виды микробов могут иметь рост с изменением окраски среды и колоний. Стафилококки очень хорошо растут на агаре манит-солевой, окраска среды из розового меняется на желтый. Важно то, что при первом же посеве из патматериала получены чистые культуры стафилококков. В мазках, окрашенных по Граму под микроскопом, были видны Грамположительные кокки, расположенные единичными формами, парами, а большинство – гроздьями, спор и капсул не образуют, неподвижны. В процессе работ неоднократно было установлено, что стафилококки росли также и на среде Симонса, цвет среды изменялся из зеленного на синий, и в приготовленных масках под микроскопом были хорошо видны только стафилококки, окрашенные по Граму положительно. После пересева на среду манит-агар получили жёлтые колони, а окраска среды изменялась из розового на желтый. В доступной нам литературе не были найдены подобные сообщения. Нами было установлено также, что стафилококки в основном выделяются из лимфатических узлов свиней, в единичных случаях – из печени. Все виды, выделенные нами энтеробактерий по Граму, были окрашены отрицательно, под микроскопом были видны небольшие палочки, с закругленными концами, споры и капсулы отсутствовали, обладали активной подвижностью. E. coli и Ent. aerogenes хорошо росли на агаре МакКонки, Салмонелла на агаре Симонса с цитратом окраска среды изменялась с зеленного на синий, а если окраска среды не меняется, то реакция считается отрицательной. При определении вида бактерий большое значение имеют также исследования биохимических свойств. Биохимическая активность выделенных из патматериалов бактерий чрезвычайно разнообразна и зависит от специфических ферментативные систем, содержащихся в клетке. Через 24 часа после постановки реакции регистрируем результаты, основываясь на изменении цвета каждого углевода.

В таблице 1 представлены три подтипа стафилококков и наименований сахаров. Ферментации сахаров обозначены знаком «+», а отсутствие ферментации данного подтипа – «-». Отсюда 5 штаммов St. aureus, 7 штаммов St. xylosus  и 4 штамма St.lentus из 12 видов сахара проявили 100% ферментацию. St. aureus раффинозу ферментировал из 5 штаммов – 1,  а ксилозу из 5 штаммов – 2. Отсутствие ферментации наблюдается в двух углеводах – ксилотол и мелибиоза. St. xylosus  из 7 штаммов не ферментировали ксилотол 3 штамма, мелибиозу – 3 штамма, рафинозу – 3 штамма. St.lentus из четырёх штаммов не ферментировали мелибиозу – 3, ксилозу – 3 и ксилотол – 1 штамм.

Таблица 1 - Сахаролитические свойства некоторых видов стафилококков, выделенных из органов свиней

Сахарные среды

St.aureus

n-5

St.xylosus

n-7

St.lentus

n-4

Глюкоза-Д

+++++

+++++++

++++

Лактоза-Д

+++++

+++++++

++++

Мальтоза-Д

+++++

+++++++

++++

Сахароза-Д

+++++

+++++++

++++

Фруктоза-Д

+++++

+++++++

++++

Манноза-Д

+++++

+++++++

++++

Триахоза-Д

+++++

+++++++

++++

Маннитол-Д

+++++

+++++++

++++

Ксилотол-Д

-----

++-++--

-+++

Мелибиоза-Д

-----

++-++--

+---

Рафиноза-Д

-+---

-+++-+-

++++

Ксилоза-Д

++---

+++++-+

+---

Примечание: «+» - присутствие ферментации сахара,

«-» - отсутствие ферментации сахара

Как видно из таблицы 1, выделенные из патматериалов штаммы подтипов стафилококк не одинаково ферментируют все указанные углеводы, особенно ксилотол,  мелибиоз, рафиноз и ксилоз, при этом в одном случае штамм данного подтипа ферментирует все указанные углеводы, в другом – частично.

В таблице 2 представлены результаты сахаролитических свойств некоторых энтеробактерий. 

Таблица 2 - Сахаролитические свойства некоторых видов энтеробактерий выделенных из органов свиней

Сахарные среды (энтеробактерии)

Salmonella typhimurium

n-4

E.coli

n-4

Enterobacteria aerogenes

n-3

Уреаза

-+--

---+

---

Глюкоза-Д

++++

++++

+++

Манитол-Д

++++

++++

+++

Инозитол

+---

----

---

Сорбитол-Д

++++

++++

+++

Раминоза-Д

++++

++++

+++

Сахароза-Д

-+++

-+++

+++

Мелибиоза-Д

++++

++++

+++

Арабиноза-Л

++++

++++

+++

Примечание: «+» - присутствие ферментации сахара,

«-» - отсутствие ферментации сахара

Из таблицы 2 видно, что 4 штамма Salmonella и 4 штамма E.coli из 9 углеводов ферментировали -6, а 3 штаммы Enterobacteria aerogenes из 9- и 7 углеводов. Указанные энтеробактерии не ферментировали уреазу, кроме 1 штамма Salmonella и E.coli. Все штаммы E.coli и Enterobacteria aerogenes не ферментировали инозитол, а Salmonella из 4 штамма – 1. Сахарозу ферментировали из 4-х 3 штамма Salmonella и E.coli.

В научной практике идентификацию выделенных из патматериалов микробных штаммов по Api тесту, типы и подтипы определяли соответствиями результатов морфологических, тинкториальных и биохимических свойств. Именно в основе Api теста лежит применение различных углеводов, результаты реакции которых оцениваются изменением цвета каждого углевода. При этом в конечном результате определяется «очень хорошая идентификация», «хорошая идентификация» данного выделенного микробного штамма. 

В таблице 3 представлены средние арифметические показатели выделенных микробных штаммов из органов здоровых свиней, полученные диско-диффузионного  методом. В таблице видно, что в графиках каждого штамма написаны три показателя – резистентность, умеренная резистентность и чувствительность, которые соответствуют размерам диаметра зон задержки роста микроба вокруг дисков антибиотиков. Учитывая многичисленность цифровых показателей, были выделены только высокие показатели резистентности и чувствительности данного штамма микроба к каждому антибиотику отдельно. Что касается низких показателей умеренной резистентности и чувствительности, то по всей вероятности, это связано с многократными использованиями данного антибиотика в виде кормовых добавок или инъекциями против возбудителей данной болезни, в результате которого, они в дальнейшем становятся более устойчивыми, а лечение – неэффективным. В последнее время на этот вопрос уделяют большое внимание, которое выражается в основном сокращением использования кормовых антибиотиков.     

Как видно из таблицы, St.aureus из 28 антибиотиков проявлял 100% чувствительность к 6-и, 80% к 6 антибиотикам. До 80% резистентность проявлял к 7-и антибиотикам. Низкие показатели чувствительности к остальным антибиотикам представлены в таблице.

St.xylosus из 28 антибиотиков имел 75-100% чувствительность только к 7 антибиотикам, а к 12 антибиотикам проявлял резистентность до 87,5%, а к остальным 9-и антибиотикам – умеренную резистентность. 

St.lentus имел большую разницу по сравнению с St. aureus и St.xylosus. При этом из 28 антибиотиков проявлял 100% чувствительность к 23 (82.10%) и только к 3 антибиотикам – 50% устойчивость. Это говорит о том, что подтип St.lentus сравнительно неустойчив к антибиотикам.

Следовательно, по результатам исследований можно заключить, что разные подтипы стафилококков, выделенные из органов здоровых свиней, не одинаково проявляют резистентность и чувствительность к многочисленным антибиотикам. Поэтому необходимо уделять внимание не только типам данного микроба, а также подтипам.

Энтеробактерий. E.coli – из 28 антибиотиков 100% чувствительность проявлял к 12 – и (42,9%) и 100% резистентность к 5-и (17,9%), а к 11 антибиотикам (39,5%) – сравнительно низкие показатели резистентности и чувствительности, то есть проявляли бактериостатистические действие.

Salmonella проявлял 100% чувствительность к 10-и антибиотикам (35,7%), а к 7-и антибиотикам 75% резистентность, а к остальным 11 антибиотикам (39,5%) – низкие и умеренные показатели резистентности и чувствительности, то есть проявляли бактериостатистические действие.

Ent.aerogenes из 28 антибиотиков проявлял 100% чувствительность к 11-и (39,3%) и 100% резистентность к 6-и  (21,4%), до 75% резистентность и чувствительность – к 11-антибиотикам (39,3%). В таблице видно, что против штамма Ent. aerogenes среди указанных антибиотиков проявляли низкие показатели резистентность и чувствительности, то есть бактериостатистические действие на микробных штаммов.                    

Таблица 3 - Средне-арифметические показатели резистентности и чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам

Анти

биотики

 

Staphylococcus

 Enterobacteriaceae

Aureus

(n=5)

Xylosus

(n=8)

Lentus

(n=4)

E.coli

(n=5)

Salmonella

(n=4)

Ent.aerogenes

(n=4)

Р, в %

У, в %

Ч, в %

Р, в %

У, в %

Ч, в %

Р, в %

У, в %

Ч, в %

Р, в %

У, в %

Ч, в %

Р, в %

У, в %

Ч, в %

Р, в %

У, в %

Ч, в %

Netilmicin 30

0

20

80

12

0

88

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

Imipenem 10

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

Streptomycin 10

60

20

20

38

24

38

0

0

100

60

0

40

50

50

0

50

0

50

Novobiocin 30

20

60

20

12,5

25

62,5

0

0

100

40

20

40

75

0

25

25

0

75

Azithromycin 15

20

20

60

62,5

0

37,5

0

0

100

60

20

20

0

0

100

25

25

50

Neomycin 30

0

60

40

12,5

12,5

75

0

0

100

0

40

60

0

0

100

0

25

75

Naildixic acid 30

80

0

20

62,5

12,5

25

50

0

50

0

0

100

50

0

50

0

0

100

Amikacin AK 30

0

20

80

12,5

12,5

75

0

0

100

0

0

100

0

50

50

0

0

100

Ceftazidime 30

40

40

20

62,5

25

12,5

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

Tetracycline 30

40

40

20

12,5

50

37,5

0

0

100

40

20

40

50

25

25

50

25

50

Ciprofloxacin 5

20

0

80

75

0

25

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

Ofloxacin 5

40

20

40

62,5

25

12,5

50

0

50

0

0

100

0

0

100

0

0

100

Norfloxacin 10

40

20

40

87,5

0

12,5

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

Polimyxin B 30

0

100

0

37,5

37,5

25

0

0

100

20

40

40

20

60

20

25

25

50

Chloramphenicol 30

20

0

80

50

12,5

37,5

0

50

50

0

0

100

60

20

20

0

0

100

Cloxacillin 5

20

40

40

12,5

25

62,5

0

0

100

100

0

0

100

0

0

100

0

0

Minocycline 30

0

0

100

12,5

12,5

75

0

0

100

0

60

40

0

0

100

100

0

0

Vancomycin 5

40

40

20

62,5

37,5

0

0

27

75

100

0

0

100

0

0

0

50

50

Penicillin 10

40

20

40

25

12,5

62

0

0

100

100

0

0

50

0

50

100

0

0

Cefotaxime 30

0

0

100

25

12,5

62,5

0

0

100

0

0

100

25

0

75

100

0

0

Amoxicillin 10

20

20

60

12,5

12,5

75

0

0

100

60

0

40

25

0

75

75

0

25

Cephalothin 30

0

0

100

0

0

75

0

0

100

60

40

0

75

0

25

50

50

0

Lincomycin 2

40

20

40

87,5

0

12,5

50

0

50

100

0

0

100

0

0

0

0

100

Levofloxacin 5

0

0

100

62,5

0

37,5

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

Chlarithromycin 15

20

0

80

50

0

50

0

0

100

40

40

20

100

0

0

25

50

25

Erythromycin 15

20

0

80

0

37,5

62,5

0

0

100

100

0

0

75

0

25

100

0

0

Ampicillin sulbactam 20

0

0

100

0

25

75

0

0

100

40

0

60

0

50

50

50

0

50

Gentamicin 10

40

20

40

12,5

25

62,5

0

0

100

0

0

100

0

75

25

100

0

0

Примечание: Р – резистентные, У - умеренно резистентные, Ч- чувствительные

4. Заключение

Основываясь на результатах исследований, можно констатировать, что в организме здоровых свиней существуют многие виды микроорганизмов и их подтипов, которые после выделения из органов во время убоя проявляли резистентность и чувствительность к 28 антибиотикам с выраженными разницами. При этом из указанных антибиотиков многие не имели бактериоцидных действий на выделенные штаммы микробов. Низкие показатели чувствительности возбудителя к антибиотикам могут быть обусловлены тем, что животных кормили обогащенными антибиотиками кормами.

Таким образом, обобщая результаты исследований, можно констатировать, что если выделенный возбудитель чувствителен (до 100%) к определенному количеству антибиотиков, тогда выражено бактерицидное действие, а при умеренной резистентности – с бактеристатическим действием. Последние блокируют репликацию и деление клеток, не вызывая их гибели. Клетки сохраняют способность к росту и при низкой резистентности организма возможен рецидив заболевания, а бактерицидное действие характеризуется гибелью клеток в присутствии антибиотика, относительно которых существуют также научные данные

.

Основываясь на результатах исследований, можно заключить, что в организме здоровых свиней существуют многие виды и подтипы микроорганизмов, которые проявляют резистентность и чувствительность к 28 антибиотикам с выраженными разницами. Некоторые подтипы выделенных микробов проявляют 100% резистентность к отдельным антибиотикам.

Из указанных антибиотиков многие не имели бактерицидного действия на разных подтипы микробов. Низкие показатели чувствительности выделенных возбудителей к отдельным антибиотикам могут являться результатом использования кормов, обогащенных этими антибиотиками.

На селективной питательной среде Агар-манит-солевой при первом же посеве из патматериала получена чистая культура стафилококков. Цвет среды из розового меняется на желтый, с ростом колоний желтого цвета. Стафилококки хорошо росли также на селективной среде «Агар Симонса с цитратом», цвет среды менялся из зеленного на синий, колонии-бесцветные, а в мазках были видны только стафилококки. После пересева на среде манит-агар, получили хороший рост колоний жёлтого цвета, с изменением цвета среды с розового на жёлтый, такие данные отсутствуют в литературе и в методиках этих сред.  

В процессе работ нами было установлено, что из всех исследованных внутренних органов свиней стафилококки выделялись из лимфатических узлов (в основном шейных) в 100%, в единичных случаях – из печени.

Установлено, что одни и те же подтипы стафилококков или энтеробактерий, выделенных из органов разных свиней, при определении идентификации и антибиотикорезистентности отличаются друг от друга, следовательно, при назначении антибиотиков в процессе лечения, необходимо проводить данные исследования.

Article metrics

Views:422
Downloads:4
Views
Total:
Views:422