Effect of Genotype for the Kappa-casein Gene on Milk Curdling Time in Cows

Свертываемость молока является одним из основных экономических признаков при производстве сыра и важна как для качества и выхода сыра, так и для контроля технологического процесса на молокоперерабатывающих предприятиях. Поэтому возможности генетического улучшения этого признака стали актуальной задачей на сегодняшний день, особенно после выявления относительно высокой распространенности индивидуальной несвертываемости молока у коров ряда пород

В течение многих лет ученые исследуют взаимосвязь качественного состава молока и признаков, характеризующих его коагуляционные свойства, в том числе время свертывания. Было обнаружено, что селекция на низкое содержание числа соматических клеток (SCS) может привести к улучшению свертываемости молока и сыропригодности, благодаря отрицательной корреляционной связи между SCS и уровнем казеина. Кроме того, высокий уровень содержания соматических клеток повышает электропроводность и pH молока

В настоящее время большой интерес, особенно в странах, где сыроделие занимает ведущее место в отрасли переработки молока (например, Италия), представляет изучение содержания лактозы, поскольку она является основным осмотическим соединением элементов молока, влияя на его физические свойства. Так, изменение состава молока после внутри выменной инфекции, особенно изменение содержания лактозы и минеральных веществ, влияет на точку замерзания молока (ТЗ, °C). Точка замерзания молока тесно коррелирует с содержанием водорастворимых соединений, ее низкие показатели могут свидетельствовать о дисбалансе рациона, его качестве. Зачастую ТЗ используется в качестве индикатора на производстве фальсификации молока водой, примеси молозива в сборном молоке. Кроме того, ТЗ коррелирует с кинетикой образования сгустка. Однако, с генетической точки зрения информации о показателях ТЗ на популяционном уровне в литературных источниках встречается мало. В связи с этим, изучение возможностей использования показателей содержания лактозы и ТЗ для селекционных целей является актуальным направлением исследований

Большой мировой проблемой во всех породах молочного скота является несвертывающееся или не коагулирующее молоко (НК). По оценкам авторов, распространенность НК молока достигает у финских айрширов – 13,3%; у итальянских голштинов и бурых швицев – 9,7 и 3,5%, соответственно; у датских голштинов – 4,8%; у шведского красного молочного скота – 18%. Определить, какие признаки одновременно могут улучшить коагуляционные свойства молока и снизить количество НК молока, нелегко, поскольку механизм, вызывающий НК молока, до сих пор неясен. Во многих исследованиях изучались генетические параметры коагуляционных свойств молока в сравнении с признаками молочной продуктивности, метаболитами и минеральными веществами. В других исследованиях из базы данных коагуляционных свойств молока просто удаляли записи с НК молоком перед оценкой генетических параметров. Однако, исследований, объединяющих изучение генетических параметров для НК молока, коагуляционных свойств, состава, физических признаков и белкового состава молока одновременно, мало

Помимо качественного состава молока, на его коагуляционные свойства также влияют генетические и экологические факторы, в частности, порода, генотипы по генам, отвечающим за тип белка, стадия лактации, кормление и ряд других, что дает направляющий вектор для разнообразных исследований

Ученые, изучая коагуляционные свойства молока и упругость творога, обнаружили, что наследуемость составляет до 0,278. Наиболее часто исследуемым геном является каппа-казеин, так как его влияние на технологические свойства молока неоднократно подтверждалось

Наиболее распространенными приборами для измерения коагуляционных свойств молока являются такие, как компьютеризированный сычугомер, Formagraph и Optigraph

Исходя из вышесказанного, в связи с необходимостью прогнозирования и выявления животных с лучшими коагуляционными свойствами молока была поставлена следующая цель научного исследования – изучить способность к свертыванию молока черно-пестрой голштинской породы во взаимосвязи с генотипом по гену каппа-казеина (CSN3) и качественным составом молока.

В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- изучить взаимосвязь факторов с технологическими свойствами и качественным составом молока;

- выявить различия состава нормального и НК молока.

Материалом исследования являлось молоко коров голштинизированной черно-пестрой породы в возрасте 1 лактации.

В лаборатории селекционного контроля качества молока на инфракрасном анализаторе молока Combi Foss FT+7 DSCC был исследован компонентный состав отобранных проб молока по следующим показателям: массовая доля жира (МДЖ), массовая доля белка (МДБ), массовая доля лактозы (МДЛ), казеина, точки замерзания (ТЗ) и кислотности (рН), количество (КСК), дифференциация соматических клеток (ДКСК).

Количество соматических клеток (КСК) в молоке коров не всегда характеризуется нормальным распределением, поэтому был рассчитан показатель оценки количества соматических клеток (ОКСК) по формуле, предложенной Wiggans G.R. и Shook G.E. (1987), которая дает выровненную оценку величины содержания КСК на контрольный день

,

где ОКСК – оценка числа соматических клеток (балл), log2 – логарифм по основанию 2, КСК – количество соматических клеток, определенное на инфракрасном спектрометре (тыс. ед/мл).

Для изучения технологических свойств отобранных проб молока были проведены исследования на термоустойчивость (алкогольная проба) и сычужную свертываемость (сычужно-бродильная проба)

Метод сычужно-бродильной пробы основан на способности молока-сырья свертываться под действием сычужного фермента, а также микроорганизмов сырого молока способствовать этому процессу за счет сбраживания лактозы и снижения pH. По характеру образовавшегося сгустка оценивают качество молока-сырья на его пригодность для производства сыра.

Скорость сычужного свертывания (оценка сыропригодности молока) определялась с помощью методики в модификации З.Х. Диланяна

В качестве реактивов для проведения проб использовались: натуральный сычужный фермент для сыра и творога CAGLIO CLERICI 50/50 (химозин телячий/пепсин бычий) активностью 100 000 ед. ВНИИМС/г; этиловый спирт 96%; глицерин.

В лаборатории молекулярной генетики сельскохозяйственных животных ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста было проведено генотипирование экспериментального стада коров с использованием чипов высокой плотности.

Статистическая обработка данных проводилась в программах MS Excel, Statistica, и в среде разработки программного обеспечения R-Studio. Были использованы методы математической статистики, включающие изучение функций распределения случайных величин, однофакторный и многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA).

При проведении многофакторного дисперсионного анализа для определения совокупного влияния факторов на показатели времени свертывания молока была построена модель с использованием метода ограниченного максимального правдоподобия (REML):

,

где, CT – время свертывания, Date – месяц взятия пробы, Gen CSN3 – генотип по гену CSN3, Alc_grade – класс молока, присвоенный по результатам алкогольной пробы.

Было проведено исследование взаимосвязи различных факторов с технологическими свойствами и качественным составом нормального и НК молока (табл. 1). Однофакторный дисперсионный анализ показал, что на время свертывания оказывали влияние все 4 рассмотренных фактора: влияние животного, месяц взятия пробы, день лактации и генотип животного. Для совокупной выборки проб с нормальным и НК молоком, влияние фактора «генотип» было лишь у трех показателей: время свертывания, pH и КСК. Фактор «влияние животного» оказал влияние на большее количество признаков (10 из 14), чем другие факторы. Фактор «месяц взятия пробы» влиял на 8 признаков, «день лактации» – на 7 признаков. На результаты исследования проб молока на термоустойчивость (алкогольная проба) и сычужную свертываемость (сычужно-бродильная проба) влияли только два фактора: месяц взятия пробы и день лактации.

В связи с тем, что при рассмотрении взаимосвязи факторов технологических свойств и качественного состава проб НК молока в отдельности, существенное влияние факторов было отмечено лишь для малого количества признаков, мы считаем, что пробы НК молока следует рассматривать в совокупности с пробами нормального молока. Интересно, что при рассмотрении нормального и НК молока как обособленно, так и в совокупности, факторы в каждой группе влияли на разные признаки. Планируется продолжить исследования в этом направлении, чтобы определить факторы, влияющие на свертывание молока.

В таблице 2 представлены статистические параметры влияния факторов генотипа по гену CSN3 и влияние животного на технологические свойства и качественный состав молока при использовании однофакторного дисперсионного анализа.

Для показателей времени свертывания молока доля влияния генотипа по гену CSN3, месяца взятия пробы, фактора животного и дня лактации составила 8, 28, 46 и 93%, соответственно. Наибольший вклад в долю изменчивости показателей качественного состава молока и его технологических свойств внесли факторы «влияние животного» и «день лактации».

В ходе исследования пробы молока были разделены на 3 группы в соответствии с генотипом по гену CSN3 коров, от которых они были отобраны: AA, AB и BB. Наибольшее среднее время свертывания было присуще молоку от коров с генотипом AA – 51,5 минут (рис. 1). Промежуточное положение заняли пробы группы AB – почти 37 минут. Пробы группы BB характеризовались в среднем самым быстрым временем свертывания – 32 минуты. Таким образом, наличие в генотипе аллеля B ускоряет свертывание молока под воздействием фермента.

Рисунок 1 - Время свертвания молока в зависимости от генотипа животного

DOI:10.23649/JAE.2023.40.5.3

В таблице 3 представлены показатели технологических признаков и качественного состава молока по группам.

В ходе исследования 16 проб не коагулировали, причем из них 12 проб были от коров с генотипом AA, и 4 пробы – с генотипом AB. У трех коров было отобрано по несколько проб НК в разные месяцы (у коровы с генотипом AB – 2 пробы, у коров с генотипами AA – 3 и 4 пробы). Молоко этих животных должно использоваться как питьевое. Предположительно, генотип BB является наиболее надежным генотипом для сыроделия, поскольку молоко таких коров является коагулирующим.

Наблюдается тенденция к увеличению времени свертывания с ростом КСК в молоке. При сравнении внутри самих групп количества соматических клеток несвернувшихся проб с КСК свернувшихся проб, были получены следующие результаты: в группе AA средний показатель КСК несвернувшихся проб был 2763 тыс. клеток, тогда как КСК свернувшихся проб – 1270 тыс. клеток. В группе AB наблюдается та же тенденция: 2073 тыс. клеток против 699 тыс. клеток.

Был проведен многофакторный дисперсионный анализ для определения совокупного влияния факторов на показатели времени свертывания молока. В ходе исследования была получена достоверная модель (P>99,9) (уравнение 1), в которой наибольшую долю изменчивости признака объясняет месяц взятия пробы (τ=0,08), фактор животного (τ=0,04), генотип животного (τ=0,03), класс по алкогольной пробе (τ=0,01). Остаточная дисперсия составила 0,11.

В R-Studio был выполнен визуальный тест на гомоскедастичность остатков для выявления их зависимости от прогнозируемых значений (рис. 2).

Так как линия тренда незначительно отклонялась от оси x, то данная модель охватывает большую часть зависимостей в выборке.

Рисунок 2 - Визуальный тест на гомоскедастичность остатков в выбранной модели

DOI:10.23649/JAE.2023.40.5.5

Также в уравнение модели был добавлен регрессионный фактор ОКСК, который оказался значимым (P>0,99). Однако в таком случае сама модель становится недостоверной. При анализе зависимости остатков от ОКСК была обнаружена небольшая зависимость, из-за чего при добавлении этого фактора коэффициент детерминации модели изменяется на 0,05, но остается задача выявить новые зависимости, чтобы модель стала достоверной.

В таблице 4 приведены статистические параметры совокупного влияния факторов генотипа по гену CSN3 и месяца взятия пробы на время свертывания молока. При проведении многофакторного дисперсионного анализа на 2 выборках: отдельно пробы с нормальным молоком, и совокупная выборка проб с нормальным и НК молоком, – результаты были одни и те же, однако для совокупной выборки достоверность результатов возрастала. Но коэффициент детерминации R2 для времени свертывания при анализе совокупной выборки был ниже, чем для выборки только с пробами нормального молока – 0,400 и 0,492, соответственно.

Метод наименьших квадратов позволяет лучше отразить закономерности развития изучаемого явления. При использовании этого метода, для совокупной выборки среднее время свертывания для групп с разными генотипами по гену CSN3 составило 0,54, 0,61 и 0,86 для BB, AB и AA, соответственно. Для отдельной выборки проб с нормальным молоком среднее время свертывания составило 0,54, 0,53 и 0,64 для BB, AB и AA, соответственно.

Результаты статистической обработки проб молока, исследуемого на физико-химические показатели, а также термостабильность и сычужную свертываемость свидетельствуют о том, что на продолжительность времени свертывания оказывают влияние такие факторы, как месяц взятия пробы, влияние животного, день лактации и генотип. Необходимость выявления животных со способностью к быстрому свертыванию молока и прогнозирования их дальнейшего продуктивного использования во взаимосвязи с генотипом по гену каппа-казеина (CSN3) и качественным составом молока является актуальным. Нами было подтверждено благоприятное влияние на продолжительность времени свертывания молока присутствие аллеля B в генотипе животных по гену CSN3.