ANALYSIS OF THE ABILITY OF BACTERIAL SYMBIONTS OF BLACK TRUFFLE FUNGI TO REGULATE PLANT GROWTH

Трюфели представляют собой уникальную группу подземных аскомицетов, которые формируют плодовые тела в тесном симбиозе с корнями растений. На всех этапах своего развития трюфели колонизированы разнообразными микроорганизмами, включая бактерии

Существует ряд исследований, которые подтверждают способность бактериальных симбионтов регулировать рост растений. Например, они могут модулировать уровень фитогормонов в корнях растений, повышать доступность питательных веществ и подавлять развитие патогенной микрофлоры. Это не только способствует увеличению урожайности, но и повышает устойчивость растений к стрессовым условиям, таким как засуха, засоление или воздействие вредителей.

Понимание экологической значимости бактериального сообщества трюфелевых грибов может привести к разработке новых методов использования симбионтов трюфелей в сельском хозяйстве. Например, можно создать биопрепараты на основе бактериальных симбионтов трюфелей для повышения урожайности и качества сельскохозяйственных культур. Такие биопрепараты могут стать альтернативой химическим удобрениям и пестицидам, что будет способствовать развитию экологически чистого сельского хозяйства.

Целью данного исследования является первичная оценка разнообразия бактерий, ассоциированных с черным трюфелем Tuber macrosporum, и их способности регулировать рост семян Sinapis alba.

Образцы плодовых тел черного трюфеля Tuber macrosporum были собраны в республике Адыгея и доставлены в г. Иркутск посредством авиасообщения в термостатируемых условиях — при температуре от +6 до  +10 °C. Далее образцы были промыты, очищены и стерилизованы 70% спиртом. Затем грибы были надломлены, стерильным скальпелем была вырезана сердцевина плодового тела, измельчена и зафиксирована в 20% растворе стерильного глицерина. 

Далее полученный водно-глицероловый экстракт был посеян газоном на твёрдые питательные среды. Для выделения бактерий-симбионтов трюфелевых грибов были выбраны следующие среды: MS (соевая мука — 20 г/л, D-маннит—20 г/л, агар—20 г/л, агар — 20 г/л), TSB (казеиновый пептон — 17 г/л, KH₂PO₄— 2,5 г/л, глюкоза — 2,5 г/л, NaCl — 5 г/л, соевый пептон — 3 г/л, агар — 20 г/л) и Гаузе-2 (триптон — 2,5 г/л, пептон — 5 г/л,  NaCl — 5 г/л, глюкоза — 10 5 г/л, агар — 20 г/л). Выделение микроорганизмов проводили в термостатируемых условиях при температуре +28 °C. Затем чистые культуры выделенных бактерий культивировали на питательной среде TSB. Идентификацию культур проводили посредством секвенирования, для чего ДНК выделяли калий-ацетатным методом

Для проведения дальнейшего эксперимента выбирали 5 штаммов, принадлежащих к наиболее различающимся друг от друга родам. Затем проводили их глубинное культивирование на следующих питательных средах: TSB (казеиновый пептон — 17 г/л, KH₂PO₄— 2,5 г/л, глюкоза — 2,5 г/л, NaCl — 5 г/л, соевый пептон — 3 г/л), MM (L-аспарагин — 0,5 г/л, K2HPO4 — 0,5 г/л, MgSO4 × 7H2O — 0,2 г/л, FeSO4 × 7H2O — 0,01 г/л, глюкоза — 10 г/л), PDA (картофельный отвар — 1 л; декстроза — 20 г/л) при температуре +28 °С в течение 7 суток. Полученные пробы разделяли на биомассу и культуральную жидкость посредством центрифугирования при 3000 rpm, 20 мин. Для экстракции вторичных метаболитов из биомассы использовали смесь ацетона с метанолом в соотношении 1:1. Для экстракции внеклеточных метаболитов использовали этилацетат.

Помимо оценки воздействия симбиотических и бактериальных культур на прорастание семян, оценивали и воздействие плодовых тел грибов на рост растений. Для этого проводили экстракцию из плодовых тел трюфелевых грибов. В рамках данного эксперимента было взято 3 типа плодовых тел: высушенные в регидраторе и нарезанные слайсами, свежие и плодовые тела, высушенные посредством заморозки. Для проведения экстракции каждый образец трюфеля измельчали в фарфоровой ступке с добавлением метанола в соотношении 1:1.

В качестве тест-объекта были выбраны семена белой горчицы (Sinapis alba), предварительно стерилизованные в растворе 5% гипохлорита натрия в течение 5 мин, затем в 70% растворе этилового спирта в течение 2 мин и 1 мин в стерильной дистиллированной воде.  Далее в чашки Петри с внутренним диаметром 60 мм помещали диск фильтровальной бумаги, на котором равномерно размещали семена S. alba в количестве 2 шт. Каждый экстракт тестировали в трехкратной повторности. Чашки с семенами инкубировали в термостате при температуре +28 °С. Общее количество семян, участвовавших в эксперименте — 340 шт. В ходе эксперимента, у S. alba определяли длину корня и побега при концентрации экстракта 5 мг/мл. Продолжительность экспериментов составляла 7суток. Контролем выступали растения, обработанные стерильной водой.

Обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Office Excel. Сравнение выборочных средних проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни. Предел погрешностей показан в виде отрезков на столбчатых диаграммах.

В ходе исследования проведена первичная оценка разнообразия культивируемых бактерий, ассоциированных с черным трюфелем T. macrosporum. С помощью секвенирования фрагментов ДНК по гену 16S рРНК получены нуклеотидные последовательности, которые были выровнены с представителями других бактерий этих же родов в системе NCBI. В результате эксперимента было выделено более 40 чистых культур, из которых идентифицировано 18. Идентифицированные бактерии принадлежали таким родам, как Bacillus sp. (35%) Microbacterium sp. (35%), Lactococcus sp. (6%), Enterococcus sp. (6%), Plantibacter sp. (6%), Paenibacillus sp. (6%), Peribacillus sp. (6%) (Таблица 1).

Показано, что в контрольных условиях длина корней проростков семян S. alba составила, в среднем 35,33 ± 20,03 мм. При обработке семян экстрактом культуральной жидкости штамма Peribacillus sp., выращенного на среде ММ, наблюдали статистически значимую индукция роста корня. Длина корня при этом составляла, в среднем, 87,8 ± 18,1 мм. Также отмечено статистически значимое ингибирование роста корня проростков S. alba до отметки 23 ± 11,8 мм, в среднем, экстрактом внеклеточных метаболитов штамма Microbacterium sp., выращенного на питательной среде TSB. Для побегов семян S. аlba, пророщенных в контрольных условиях, установлена средняя длина 15,7 ± 5,6 мм. При обработке семян экстрактом культуральной жидкости штамма Paenibacillus sp, выращенного на среде TSB, наблюдали выраженное ингибирование роста побегов до 2,3 ± 1,3 мм. В то же время экстракты этого же штамма, выращенного на среде PDA, способны статистически значимо увеличивать рост побегов до 22,9 ± 10,4 мм (рис. 1).

Рисунок 1 - Длина побега (А) и корня (Б) 7-суточных проростков семян S. alba при обработке экстрактами культуральной жидкости бактерий-симбионтов черного трюфеля

Примечание: символом «*» отмечены статистически отличные данные от контроля

DOI:10.60797/JAE.2025.59.10.2

При обработке семян белой горчицы экстрактами биомассы штамма Plantibacter sp., культивированного на питательной среде ММ, отмечали статистически значимое увеличивание длины корней до отметки 72,1 ± 36,19 мм. Внутриклеточные вторичные метаболиты бактерий-симбионтов трюфеля, культивированных на среде PDA, не оказывали статистически-значимых эффектов на длину корней 7-суточных проростков белой горчицы. Среди экстрактов, выделенных из биомассы всех исследуемых штаммов, только штамм рода Microbacterium sp. оказывал статистически значимый стимулирующий эффект, удлиняя побеги до 35,3 ± 7,06 мм. Обратный эффект на проростки семян S. alba оказали экстракты биомассы штамма Plantibacter sp., культивированного на питательной среде TSB. Данные экстракты статистически значимо ингибировали рост побегов тест-растений до отметки 2,33 ± 1,9 мм (рис. 2).

Рисунок 2 - Длина побега (А) и корня (Б) 7-суточных проростков семян Sinapis alba при обработке экстрактами биомассы бактерий-симбионтов черного трюфеля

Примечание: символом «*» отмечены статистически отличные данные от контроля

DOI:10.60797/JAE.2025.59.10.3

Экстракты черного трюфеля оказывали незначительное воздействие на прорастание семян S. аlba. Наибольшее воздействие оказали экстракты регидрированных слайсов грибов. Длина корней таких растений в среднем составляла 50,45± 24,9 мм (рис. 3).

Рисунок 3 - Длина побега (А) и корня (Б) 7-суточных проростков семян Sinapis alba при обработке экстрактами черного трюфеля

Примечание: символом «*» отмечены статистически отличные данные от контроля; СС – экстракты сушеных слайсов плодовых тел черного трюфеля; СЗ – экстракты сушеных замороженных плодовых тел черного трюфеля; З – экстракты замороженных плодовых тел черного трюфеля

DOI:10.60797/JAE.2025.59.10.4

В рамках проведённого исследования была выполнена первичная оценка разнообразия бактерий, ассоциированных с чёрным трюфелем. Для этого использовали метод секвенирования фрагментов ДНК по гену 16S рРНК. Анализ полученных данных показал, что среди культивируемых симбионтов чёрного трюфеля были обнаружены представители следующих родов бактерий: Bacillus sp., Microbacterium sp., Lactococcus sp., Enterococcus sp., Plantibacter sp., Paenibacillus sp., Peribacillus sp. Эти бактерии широко распространены в окружающей среде и могут играть важную роль в экосистемах. Особое внимание привлекли бактерии родов Microbacterium sp., Plantibacter sp., Paenibacillus sp. и Peribacillus sp., так как они известны своей способностью регулировать рост растений. Именно эти штаммы были выбраны для дальнейшего изучения в рамках исследования. Кроме того, было отмечено, что бактерии рода Bacillus и Lactococcus способны проявлять антагонистическую активность в отношении множества патогенов растений. Это означает, что они могут подавлять рост и развитие вредных микроорганизмов, защищая растения от болезней. Бактерии рода Bacillus также известны своим положительным влиянием на рост и иммунитет сельскохозяйственных культур, что делает их перспективными кандидатами для использования в агротехнологиях

Эксперименты с использованием метанольных экстрактов чёрного трюфеля и экстрактов, выделенных из биомассы и культуральной жидкости его бактерий-симбионтов, продемонстрировали заметное влияние на прорастающие семена S. alba. В частности, было обнаружено, что экстракт культуральной жидкости штамма Peribacillus sp. стимулирует увеличение длины корня. Это указывает на способность данного штамма выделять в окружающую среду фитогормоны, которые могут влиять на рост растений. Этот вывод подтверждается исследованием Rodríguez et al., 2022, в котором показано, что штамм Peribacillus sp. способствует росту томатов. Кроме того, у этого штамма обнаружены гены, ответственные за синтез веществ ауксиновой природы, что также указывает на его способность стимулировать рост растений

С другой стороны, эксперименты с экстрактами, содержащими внеклеточные метаболиты штамма Microbacterium sp., культивированного на среде TSB, показали ингибирование роста корней проростков. Это указывает на возможное наличие в этих экстрактах соединений с антагонистическими свойствами, которые могут подавлять рост растений. Однако в ходе исследования также было обнаружено, что экстракты биомассы Microbacterium sp., выращенной на среде MM, наоборот, способны стимулировать рост растений. Это подчёркивает значимость условий культивирования бактерий и состава используемых сред, которые могут существенно влиять на свойства получаемых экстрактов.

Литературные источники также содержат упоминания о способности экстрактов бактерий рода Microbacterium sp. стимулировать рост растений. Это подтверждает предположение о том, что бактерии этого рода могут вырабатывать вещества, положительно влияющие на развитие растений, хотя конкретные механизмы и действующие компоненты требуют дальнейшего изучения

Представляется значимым отметить, что экстракты биомассы штамма Plantibacter sp., культивированного на среде ММ, значительно увеличили длину корней у семян белой горчицы. В то же время экстракты того же штамма, выращенного на среде PDA, не оказали заметного влияния. Это наблюдение подчёркивает, как среда культивирования может влиять на метаболический профиль бактерий и, соответственно, на их взаимодействие с растениями. Результаты исследования фитостимулирующих эффектов экстрактов плодовых тел чёрных трюфелей показали, что сами по себе экстракты не оказывали значительного влияния на рост семян S. alba. Однако экстракты из сушёных слайсов трюфелей смогли стимулировать рост корней белой горчицы. Это указывает на то, что определённые соединения, входящие в состав чёрного трюфеля, сохраняют свои свойства даже после высушивания и длительного хранения. Полученные данные подчёркивают перспективность дальнейшего изучения бактерий, ассоциированных с чёрным трюфелем, и их экстрактов в контексте регуляции роста растений. Понимание механизмов взаимодействия между этими микроорганизмами и растениями может открыть новые возможности для агрономии. Например, использование этих бактерий может помочь повысить урожайность и устойчивость сельскохозяйственных культур к неблагоприятным условиям.

Таким образом, проведенное исследование выявило несколько уникальных родов культивируемых симбиотических бактерий, включая роды Bacillus sp., Microbacterium sp., Lactococcus sp., Enterococcus sp., Plantibacter sp., Paenibacillus sp. и Peribacillus sp. Особое внимание уделено таким штаммам, как Microbacterium sp., Plantibacter sp., Paenibacillus sp. и Peribacillus sp., благодаря их способности регулировать рост и развитие растений. Эксперименты с экстрактами данных бактерий продемонстрировали как стимулирующие, так и ингибирующие эффекты на прорастающие семена белой горчицы (S. alba) в зависимости от выбора питательной среды для их культивации. Например, экстракт, содержащий внеклеточные метаболиты штамма Microbacterium sp., культивированного на среде TSB, показал ингибирование роста корней проростков, в то время как экстракт того же типа данного штамма при культивации на питательной среде ММ показывает увеличение роста побега проростков.

Кроме того, результаты показали, что экстракты плодовых тел черного трюфеля, несмотря на отсутствие значимого эффекта на семена S. alba, все же способны стимулировать рост корней у проростков белой горчицы. Об этом свидетельствует статистически значимое увеличение длины корня проростков S. alba при обработке семян экстрактами сушеных слайсов трюфелевых грибов. Кроме того, данная особенность подтверждает сохранение биологически активных соединений даже после высушивания и длительного хранения.

Так, исследования взаимодействий микроорганизмов-симбионтов трюфеля с растениями имеют большое значение для понимания их биологических эффектов. Возможно, соединения, которые синтезируют микроорганизмы, играют ключевую роль в процессах микоризообразования и формирования плодового тела трюфеля. Детальное изучение этих взаимодействий может помочь выявить механизмы, с помощью которых микроорганизмы влияют на рост и развитие растений, что открывает новые горизонты для их использования в агрономии и биотехнологии.