The influence of various methods of sterilization of alfalfa explants on the effectiveness of their introduction into in vitro culture
The influence of various methods of sterilization of alfalfa explants on the effectiveness of their introduction into in vitro culture
Abstract
In this work, we studied the effect of various sterilizing agents (sulphuric acid, hydrogen peroxide, bleach) on the condition of alfalfa (Medicago sativa L.) explants in in vitro culture. The most effective and gentle protocol was sequential treatment with 70% ethanol for 30 seconds followed by sterilization with a bleach solution (sodium hypochlorite) at a concentration of 8% with an immersion exposure of 6 minutes. This method demonstrated the maximum yield of viable and sterile explants (85%), which was confirmed by a low level of contamination (15%) and the absence of visual signs of phytotoxicity. The developed protocol is necessary for the propagation of valuable alfalfa genotypes for their further use in fundamental and applied research, as well as in breeding work.
1. Введение
Современная селекция сельскохозяйственных культур все в большей степени опирается на достижения геномики, позволяющие прогнозировать ценность генотипа по данным полногеномного анализа. Однако для полиплоидных многолетних видов, к которым относится ключевая кормовая культура — люцерна посевная (Medicago sativa L.), внедрение этих подходов сталкивается с системными трудностями . Сложность сборки и аннотации генома, обусловленная автотетраплоидностью и высоким уровнем гетерозиготности, усугубляется отсутствием эффективных методов получения большого количества генетически однородного биоматериала . Традиционное семенное размножение приводит к генетическому расщеплению, а вегетативное размножение в полевых условиях характеризуется крайне низкой эффективностью из-за ограниченной побегообразовательной способности и медленных темпов роста корневой системы. Исключение составляет деление корневой шейки куста, но этот метод не позволяет достичь нужных масштабов и стерильности , . Таким образом, получение высококачественных геномов и последующая геномная селекция люцерны посевной требуют принципиально иного подхода к размножению исходного материала.
Анализ литературных данных показывает, что большинство методик клонального микроразмножения люцерны посевной основаны на использовании семян, в то время как для задач геномного анализа принципиально важно работать с вегетативным материалом конкретного генотипа . Однако использование вегетативных эксплантов от взрослых материнских растений сопряжено с существенными трудностями, в частности, с высокой степенью эндогенной и экзогенной контаминации, что требует разработки специализированных протоколов стерилизации.
В связи с этим нами был проведен эксперимент по оптимизации условий стерилизации вегетативных эксплантов люцерны посевной, отобранных от ценных селекционных генотипов. В ходе исследования оценивалась эффективность различных стерилизующих агентов, направленных на максимальное подавление микробиологической контаминации при сохранении жизнеспособности меристематических тканей. Особое внимание уделялось подбору концентраций дезинфицирующих растворов и продолжительности экспозиции, позволяющих обеспечить успешное введение в культуру in vitro пазушных почек от полевых растений.
Цель работы — разработка эффективного протокола стерилизации вегетативных эксплантов люцерны посевной, обеспечивающего получение стабильных асептических культур для клонального микроразмножения генетически однородного материала, пригодного для молекулярно-генетических исследований и селекционных работ.
2. Методы и принципы исследования
Использовали сорт Mulfeuil люцерны посевной (Medicago sativa L.), предоставленный Федеральным исследовательским центром «Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова» (г. Санкт-Петербург). В качестве исходных эксплантов использовали одноузловые сегменты длиной 20±5 мм, взятые из нижней части растения и содержащие пазушную почку и прилегающие к ней участки междоузлий , . Предварительная подготовка материала включала тщательную промывку в проточной воде с добавлением 0,1% моющего средства в течение 30 минут для удаления поверхностных загрязнений и снижения бактериальной нагрузки.
Последовательность стерилизации состояла из трех этапов:
1. Предварительная обработка 70% этанолом в течение 30 секунд для обезжиривания поверхности и дегидратации микроорганизмов.
2. Стерилизация исследуемыми агентами с варьируемой экспозицией (Таблица 1).
3. Трехкратная отмывка стерильной дистиллированной водой для полного удаления остатков стерилизующих веществ.
Между каждым этапом проводили асептические манипуляции по переносу эксплантов в новые стерильные емкости. После экспланты культивировали на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга , , . Выращивание проводили при температуре 24±2 °C, 16-часовом фотопериоде и освещении люминесцентными фитолампами с мультиспектральным излучением с интенсивностью 4000 лк. Контроль эффективности стерилизации осуществляли визуально по отсутствию признаков микробной контаминации. Для каждого варианта стерилизации использовали по 20 эксплантов.
Таблица 1 - Режимы стерилизации эксплантов люцерны посевной при введении в культуру in vitro
Стерилизующий агент | Концентрация, % | Время экспозиции, мин |
Сулема (HgCl2) | 0,1 | 1 |
Сулема (HgCl2) | 0,1 | 2 |
Сулема (HgCl2) | 0,1 | 6 |
Белизна (NaOCl) | 6 | 8 |
Белизна (NaOCl) | 8 | 6 |
Перекись водорода (H2O2) | 10 | 10 |
Перекись водорода (H2O2) | 15 | 15 |
3. Основные результаты и обсуждение
Провели сравнительный анализ различных режимов стерилизации эксплантов люцерны посевной (Таблица 1). Результаты сравнительного анализа показали преимущество варианта с использованием 8% раствора белизны (гипохлорита натрия), который обеспечивал максимальный выход жизнеспособных эксплантов (85%) при минимальном уровне контаминации (15%) (Таблица 2). При использовании сулемы жизнеспособные растения отсутствовали, а при применении перекиси водорода наблюдался низкий процент жизнеспособных растений (5–10%) при высоком уровне контаминации (45–65%). На рисунке 1 представлены экспланты люцерны посевной, стерилизованные раствором белизны, на 14-й день культивирования в условиях in vitro.
Таблица 2 - Оценка жизнеспособности и стерильности растений в зависимости от способа стерилизации
Стерилизующий агент | Жизнеспособные, % | Уровень контаминации, % | Некроз, % |
Сулема (HgCl2) 0,1%, 1 мин | 0 | 20 | 80 |
Сулема (HgCl2) 0,1%, 2 мин | 0 | 5 | 95 |
Сулема (HgCl2) 0,1%, 6 мин | 0 | 0 | 100 |
Белизна (NaOCl) 6%, 8 мин | 50 | 30 | 20 |
Белизна (NaOCl) 8%, 6 мин | 85 | 15 | 0 |
Перекись водорода (H2O2) 10%, 10 мин | 10 | 65 | 25 |
Перекись водорода (H2O2) 15%, 15 мин | 5 | 45 | 50 |
Рисунок 1 - Экспланты люцерны посевной, стерилизованные раствором белизны, на 14-й день культивирования в условиях in vitro
Полученные результаты убедительно демонстрируют эффективность разработанного двухэтапного протокола стерилизации эксплантов люцерны посевной с использованием 70% этанола (30 с) и 8% раствора гипохлорита натрия (6 мин). Данный режим обеспечил максимальный выход жизнеспособных эксплантов — 85%, что значительно превысило показатели при использовании альтернативных схем обработки. Столь высокая эффективность обусловлена синергетическим действием компонентов: этанол обеспечивал быстрое обезжиривание поверхности и дегидратацию клеточных оболочек микроорганизмов, а гипохлорит натрия проникал в поврежденные структуры и осуществлял их инактивацию за счет окислительного действия.
Значимые различия в выживаемости эксплантов между предложенным методом и другими исследованными вариантами (обработка сулемой 0,1% и перекисью водорода 10-15%) подтверждают избирательную фитотоксичность последних. Так, использование сулемы даже при минимальной экспозиции (1 мин) приводило к некрозу меристематических тканей, а более низкие концентрации перекиси водорода (10%) не обеспечивали достаточной стерильности.
Стандартизированные временные интервалы и концентрации должны позволить интегрировать данный протокол в рабочие процессы биотехнологических лабораторий без необходимости дополнительной оптимизации для каждого конкретного генотипа люцерны посевной. Это особенно значимо для селекционных работ, где требуется массовое введение в культуру in vitro ценных образцов с сохранением их генетической стабильности.
4. Заключение
На основании проведенных исследований установлена эффективность применения двухэтапного протокола стерилизации вегетативных эксплантов люцерны посевной. Определены оптимальные параметры обработки: предварительная стерилизация 70% этанолом в течение 30 секунд с последующей обработкой 8% раствором гипохлорита натрия в течение 6 минут. Данный протокол обеспечивает максимальный выход жизнеспособных эксплантов (85%) при минимальном уровне контаминации (15%) и полном отсутствии некротических повреждений тканей. Разработанный протокол необходим для размножения ценных генотипов люцерны посевной с целью их дальнейшего использования в фундаментальных и прикладных исследованиях, а также селекционной работе.