1. Введение
Современная селекция сельскохозяйственных культур все в большей степени опирается на достижения геномики, позволяющие прогнозировать ценность генотипа по данным полногеномного анализа. Однако для полиплоидных многолетних видов, к которым относится ключевая кормовая культура — люцерна посевная (Medicago sativa L.), внедрение этих подходов сталкивается с системными трудностями [1]. Сложность сборки и аннотации генома, обусловленная автотетраплоидностью и высоким уровнем гетерозиготности, усугубляется отсутствием эффективных методов получения большого количества генетически однородного биоматериала [2]. Традиционное семенное размножение приводит к генетическому расщеплению, а вегетативное размножение в полевых условиях характеризуется крайне низкой эффективностью из-за ограниченной побегообразовательной способности и медленных темпов роста корневой системы. Исключение составляет деление корневой шейки куста, но этот метод не позволяет достичь нужных масштабов и стерильности [3], [4]. Таким образом, получение высококачественных геномов и последующая геномная селекция люцерны посевной требуют принципиально иного подхода к размножению исходного материала.
Анализ литературных данных показывает, что большинство методик клонального микроразмножения люцерны посевной основаны на использовании семян, в то время как для задач геномного анализа принципиально важно работать с вегетативным материалом конкретного генотипа [5]. Однако использование вегетативных эксплантов от взрослых материнских растений сопряжено с существенными трудностями, в частности, с высокой степенью эндогенной и экзогенной контаминации, что требует разработки специализированных протоколов стерилизации.
В связи с этим нами был проведен эксперимент по оптимизации условий стерилизации вегетативных эксплантов люцерны посевной, отобранных от ценных селекционных генотипов. В ходе исследования оценивалась эффективность различных стерилизующих агентов, направленных на максимальное подавление микробиологической контаминации при сохранении жизнеспособности меристематических тканей. Особое внимание уделялось подбору концентраций дезинфицирующих растворов и продолжительности экспозиции, позволяющих обеспечить успешное введение в культуру in vitro пазушных почек от полевых растений.
Цель работы — разработка эффективного протокола стерилизации вегетативных эксплантов люцерны посевной, обеспечивающего получение стабильных асептических культур для клонального микроразмножения генетически однородного материала, пригодного для молекулярно-генетических исследований и селекционных работ.
2. Методы и принципы исследования
Использовали сорт Mulfeuil люцерны посевной (Medicago sativa L.), предоставленный Федеральным исследовательским центром «Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова» (г. Санкт-Петербург). В качестве исходных эксплантов использовали одноузловые сегменты длиной 20±5 мм, взятые из нижней части растения и содержащие пазушную почку и прилегающие к ней участки междоузлий [6], [7]. Предварительная подготовка материала включала тщательную промывку в проточной воде с добавлением 0,1% моющего средства в течение 30 минут для удаления поверхностных загрязнений и снижения бактериальной нагрузки.
Последовательность стерилизации состояла из трех этапов:
1. Предварительная обработка 70% этанолом в течение 30 секунд для обезжиривания поверхности и дегидратации микроорганизмов.
2. Стерилизация исследуемыми агентами с варьируемой экспозицией (Таблица 1).
3. Трехкратная отмывка стерильной дистиллированной водой для полного удаления остатков стерилизующих веществ.
Между каждым этапом проводили асептические манипуляции по переносу эксплантов в новые стерильные емкости. После экспланты культивировали на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга [8], [9], [10]. Выращивание проводили при температуре 24±2 °C, 16-часовом фотопериоде и освещении люминесцентными фитолампами с мультиспектральным излучением с интенсивностью 4000 лк. Контроль эффективности стерилизации осуществляли визуально по отсутствию признаков микробной контаминации. Для каждого варианта стерилизации использовали по 20 эксплантов.
Режимы стерилизации эксплантов люцерны посевной при введении в культуру in vitro
| Стерилизующий агент | Концентрация, % | Время экспозиции, мин |
| ) | 0,1 | 1 |
| ) | 0,1 | 2 |
| ) | 0,1 | 6 |
| Белизна (NaOCl) | 6 | 8 |
| Белизна (NaOCl) | 8 | 6 |
| ) | 10 | 10 |
| ) | 15 | 15 |
3. Основные результаты и обсуждение
Провели сравнительный анализ различных режимов стерилизации эксплантов люцерны посевной (Таблица 1). Результаты сравнительного анализа показали преимущество варианта с использованием 8% раствора белизны (гипохлорита натрия), который обеспечивал максимальный выход жизнеспособных эксплантов (85%) при минимальном уровне контаминации (15%) (Таблица 2). При использовании сулемы жизнеспособные растения отсутствовали, а при применении перекиси водорода наблюдался низкий процент жизнеспособных растений (5–10%) при высоком уровне контаминации (45–65%). На рисунке 1 представлены экспланты люцерны посевной, стерилизованные раствором белизны, на 14-й день культивирования в условиях in vitro.
Оценка жизнеспособности и стерильности растений в зависимости от способа стерилизации
| Стерилизующий агент | Жизнеспособные, % | Уровень контаминации, % | Некроз, % |
| 0,1%, 1 мин | 0 | 20 | 80 |
| 0,1%, 2 мин | 0 | 5 | 95 |
| 0,1%, 6 мин | 0 | 0 | 100 |
| 6%, 8 мин | 50 | 30 | 20 |
| 8%, 6 мин | 85 | 15 | 0 |
| 10%, 10 мин | 10 | 65 | 25 |
| 15%, 15 мин | 5 | 45 | 50 |
Экспланты люцерны посевной, стерилизованные раствором белизны, на 14-й день культивирования в условиях in vitro
Ключевым отличием подхода с использованием белизны от известных аналогов является сочетание двух принципиальных особенностей. Во-первых, в сравнении с перекисью водорода способ обеспечивает более мягкое воздействие на меристематические ткани без возникновения окислительного шока, что подтверждается увеличением выхода жизнеспособных эксплантов. Во-вторых, в отличие от сулемы, метод исключает использование мутагенных соединений и не обладает кумулятивным токсическим эффектом. Также преимуществом является то, что подход с использованием белизны не предполагает применения гормональных препаратов на этапе предстерилизационной подготовки, что исключает потенциальное эпигенетическое влияние и обеспечивает сохранение исходных генетических характеристик генотипа.
Полученные результаты убедительно демонстрируют эффективность разработанного двухэтапного протокола стерилизации эксплантов люцерны посевной с использованием 70% этанола (30 с) и 8% раствора гипохлорита натрия (6 мин). Данный режим обеспечил максимальный выход жизнеспособных эксплантов — 85%, что значительно превысило показатели при использовании альтернативных схем обработки. Столь высокая эффективность обусловлена синергетическим действием компонентов: этанол обеспечивал быстрое обезжиривание поверхности и дегидратацию клеточных оболочек микроорганизмов, а гипохлорит натрия проникал в поврежденные структуры и осуществлял их инактивацию за счет окислительного действия.
Значимые различия в выживаемости эксплантов между предложенным методом и другими исследованными вариантами (обработка сулемой 0,1% и перекисью водорода 10-15%) подтверждают избирательную фитотоксичность последних. Так, использование сулемы даже при минимальной экспозиции (1 мин) приводило к некрозу меристематических тканей, а более низкие концентрации перекиси водорода (10%) не обеспечивали достаточной стерильности.
Стандартизированные временные интервалы и концентрации должны позволить интегрировать данный протокол в рабочие процессы биотехнологических лабораторий без необходимости дополнительной оптимизации для каждого конкретного генотипа люцерны посевной. Это особенно значимо для селекционных работ, где требуется массовое введение в культуру in vitro ценных образцов с сохранением их генетической стабильности.
4. Заключение
На основании проведенных исследований установлена эффективность применения двухэтапного протокола стерилизации вегетативных эксплантов люцерны посевной. Определены оптимальные параметры обработки: предварительная стерилизация 70% этанолом в течение 30 секунд с последующей обработкой 8% раствором гипохлорита натрия в течение 6 минут. Данный протокол обеспечивает максимальный выход жизнеспособных эксплантов (85%) при минимальном уровне контаминации (15%) и полном отсутствии некротических повреждений тканей. Разработанный протокол необходим для размножения ценных генотипов люцерны посевной с целью их дальнейшего использования в фундаментальных и прикладных исследованиях, а также селекционной работе.