ADVANCES IN POTATO GENOME EDITING

Review article
DOI:
https://doi.org/10.60797/JAE.2024.51.21
Issue: № 11 (51), 2024
Submitted :
05.11.2024
Accepted:
14.11.2024
Published:
19.11.2024
109
2
XML
PDF

Abstract

The efficiency and accuracy of plant genome editing approaches are improving every year, thus greatly enhancing the potential for improving various crop traits. Potato is the most important vegetable and technical crop grown in all regions of the world. Potato is a vegetatively propagated tetraploid plant species with high heterozygosity, therefore the successful application of different genome editing systems such as CRISPR/Cas or TALEN requires a lot of effort, time and appropriate methodological approaches. Over the past decade, potato gene editing research has led to changes in starch composition and improved tuber quality, increased plant resistance to phytopathogens, viruses, herbicides and abiotic stresses. This review summarizes the main directions and achievements of potato gene editing.

1. Введение

Картофель (Solanum tuberosum L.) считается важной сельскохозяйственной культурой как в развитых, так и в развивающихся странах. Он широко используется не только для потребления в пищу, но также для промышленной переработки (производство крахмала, спирта и др. фармацевтических субстанций) и рекультивации

. Картофель является четвертой сельскохозяйственной культурой по величине валового сбора в мире после кукурузы, риса и пшеницы. Традиционные методы селекции картофеля направлены на повышение урожайности, улучшение пищевой ценности, качества переработки и хранения клубней. Выращивание картофеля сталкивается с рядом проблем, связанных с рядом абиотических стрессов, таких как засуха, засоление, неустойчивая температура, заморозки, эрозия почвы и др. Помимо этого, картофель уязвим примерно к 50-ти различным типам вредителей и болезней, вызываемых вирусами, бактериями, грибами, нематодами и насекомыми, что требует постоянного обновления сортимента
. Высокая гетерозиготность и тетраплоидный характер генома картофеля являются немаловажными сдерживающими факторами усилий селекционеров по улучшению картофеля. Для его совершенствования можно использовать не только традиционную селекцию, но и различные биотехнологические подходы, появившиеся в последнее десятилетие, позволяющие ускорить селекционный процесс. К таким подходам относится редактирование генома с помощью различных молекулярно-биологических инструментов, таких как CRISPR/Cas9 системы, а также цинковые пальцы (ZNF) и TALEN нуклеазы
. Все они основаны на изменении нуклеотидной последовательности целевых генов на уровне клеток, с дальнейшей регенерацией из них полноценных растений. Обычно генетические конструкции, несущие последовательности редактирования генома, доставляются в растительные клетки путем генетической трансформации с использованием Agrobacterium, бомбардировки частицами и трансфекции протопластов. Подавляющее большинство генетически отредактированных растений (90%) получено путем агробактериальной трансформации
. Используя транзиентную экспрессию, можно осуществлять редактирование генома без введения в геном растений последовательностей, кодирующих компоненты систем редактирования ДНК.

Первыми растениями, подвергшимися редактированию генома, были сельскохозяйственные культуры – кукуруза, рис и томат, а также модельные растения – табак и Арабидопсис

. Первые растения картофеля с отредактированным геномом были получены десять лет назад в 2014 г.
. Исследования показывают, что геномное редактирование у полиплоидных видов растений, к которым относится картофель, менее эффективно, так как для полноценного проявления признака необходимо внести мутации во все аллели. Картофель характеризуется недетерминантным типом развития, что позволяет его легко поддерживать путем вегетативного размножения клубнями или черенками в культуре клеток и тканей in vitro. Однако при неполном редактировании, когда не удается индуцировать мутации у всех гомеологов, гомозиготные мутанты в дальнейшем можно получить только путем скрещивания, что приводит к потере сортовой специфичности. В данном обзоре рассмотрены различные аспекты и достижения редактирования генома картофеля за десять лет применения этой биотехнологии, направленные не только на совершенствование способов геномного редактирования картофеля, но и на улучшение его различных признаков и свойств.

2. Доставка инструментов редактирования генов в клетки картофеля

Для успешного применения любого из существующих инструментов редактирования генов важно доставить его в растительные клетки, способные к регенерации. Чаще всего этого можно достичь путем генетической трансформации различных соматических тканей картофеля, таких как листовые экспланты, стеблевые сегменты или клубневые диски с помощью A. tumefaciens или A. rhizogenes. Также можно использовать ПЭГ- опосредованную трансфекцию или бомбардировку протопластов (Табл. 1). Анализ литературных данных показывает, что в зависимости от используемых методик доставки и ряда сопутствующих условий, эффективность трансформации может отличаться. Например, в исследовании

с использованием A. tumefaciens для трансформации листовых и стеблевых эксплантов эффективность варьировала от 0 до 19,2% в зависимости от генотипа, при этом индукция побегов из клеток стебля была лучше, чем из клеток листа. По данным различных литературных источников (Табл. 1), эффективность доставки инструментов геномного редактирования в клетки картофеля при использовании A. rhizogenes – от 7% до 68,8%
, тогда как при использовании A. tumefaciens может составлять от 0 до 100%
. Другой часто используемый метод – ПЭГ-трансфекция протопластов картофеля – позволяет доставлять генетические конструкции с частотой до 39%
. Несмотря на более низкую эффективность, ПЭГ-опосредованная трансфекция позволяет осуществлять временную экспрессию инструментов редактирования генов в виде рибонуклеопротеинов (РНП), транскрибированных in vitro РНК, а также плазмид
. Существуют данные о возможности редактирования генов картофеля бомбардировкой и инфильтрацией комплексов РНП, иммобилизованных на микрочастицах хитозана
. Благодаря таким методологическим подходам получаемые растения картофеля не являются трансгенными, поскольку не содержат чужеродных вставок вследствие переноса Т-ДНК из A. tumefaciens или A. rhizogenes.

3. Оптимизация методов геномного редактирования картофеля

Первое редактирование генома картофеля осуществлено в 2014 году с использованием системы TALEN. Изменению подвергался ген редуктазы боковой цепи стерола (SSR2), ответственной за синтез растительного холестерина и предшественника токсичных стероидных гликоалкалоидов

, при этом данных об эффективности редактирования не было приведено. В 2015 году сразу в нескольких лабораториях было выполнено геномное редактирование различных сортов картофеля с использованием TALEN и CRISPR/Cas9 систем
,
,
,
. С этого времени опубликовано более 37-ми работ, посвященных как методологическим аспектам геномного редактирования, так и целевой модификации генов картофеля, имеющей практическое значение (Табл. 1).

Для разработки эффективных протоколов редактирования картофеля в ряде работ использовали гены-мишени, которые позволяют легко обнаружить фенотипические проявлении при наличии мутаций. Так, в нескольких работах были представлены данные об использовании CRISPR/Cas9 и TALEN систем для редактирования гена ацетолактатсинтазы ALS (определяет устойчивость к гербициду) с целью выяснения влияния используемой системы экспрессии на эффективность редактирования генов

,
,
,
. В другом исследовании ген ALS использовали в качестве маркера для выявления успешного нокаута 5'-UTR гена Ubi7 картофеля после временной экспрессии инструментов редактирования TALEN для создания растений с сайт-специфически интегрированной Т-ДНК
. Помимо гена ALS, для разработки методологии редактирования генома картофеля использовали ген зеленого флуоресцентного белка GFP
, ген флаванон-3-гидроксилазы F3H
и ген фитоендесатуразы PDS
,
. Так, нокаут гена PDS приводит к появлению хлорофилл-дефицитных пятен на листьях или растения становятся полностью альбиносными в результате нарушения функциональной активности фермента фитоендесатуразы, катализирующей ключевую стадию биосинтеза каротиноидов. Нокаут GFP в ранее полученных трансгенных растениях, позволил оценить эффективность редактирования за счет изменения флуоресценции клеток
. Антоцианы, придающие тканям картофеля красный и фиолетовый цвет, не могут образовываться, если произошел успешный нокаут гена F3H, поэтому изменение окраски цветов и клубней (на белый или желтый) служат характеристикой эффективности геномного редактирования, которые легко заметить и оценить во время выращивания
. Несмотря на возможность использования указанных и подобных генов для оптимизации процесса геномного редактировании картофеля, большинство исследователей предпочитает оттачивать методические подходы непосредственно на целевых-генах мишенях, имеющих прикладное или научное значение (Табл. 1). Например, обнаружено, что осмотический стресс может увеличить эффективность редактирования генома картофеля методом CRISPR/Cas9, при этом, целевой модификации подвергался ген Like3, фермент которого участвует в катализе определенных этапов метаболизма глюкозинолатов для защиты растений
.

Таблица 1 - Успехи модификации генов картофеля при использовании различных технологий геномного редактирования

Год публикации

Способ доставки и тип экспланта

Система редактирования

Цель генетического редактирования

Ген/ы

Ссылка

2014

Трансформация A. tumefaciens клубневых дисков

TALEN

Изменение метаболизма

SSR2

2015

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Методология, изменение метаболизма

IAA2

2015

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Методология

ALS1

2015

Трансфекция протопластов

TALEN

Качество клубней

VInv

2015

Трансфекция протопластов

TALEN

Методология

ALS

2016

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9 и TALEN

Методология

ALS1

2016

Трансформация A. tumefaciens

TALEN

Методология

Ubi7, ALS

2017

Трансфекция протопластов

CRISPR/Cas9

Методология, качество клубней

GBSS

2017

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

TALEN

Методология, качество клубней

vacINV2

SBE1

2017

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Устойчивость к абиотическому стрессу

MYB44

2018

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Методология, качество клубней

GBSS

2018

Трансформация А. rhizogenes

CRISPR/Cas9

Изменение метаболизма

16DOX

2018

Трансфекция протопластов

CRISPR/Cas9

Методология, качество клубней

GBSS

2018

Бомбардировка и вакуумная инфильтрация меристем

CRISPR/Cas9

Методология

COIL

2018

Бомбардировка и вакуумная инфильтрация меристем

CRISPR/Cas9

Методология

PDS

2019

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

TALEN

Изменение метаболизма, качество клубней

SSR2

2019

Трансфекция протопластов

CRISPR/Cas9

Методология, качество клубней

GBSS

2019

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Методология

ALS

2020

Трансфекция протопластов

CRISPR/Cas9

Качество клубней

PPO2

2021

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Методология, качество клубней

PPO1

PPO2

vacINV1

BAM1

2021

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Устойчивость к биотическим стрессам

MLO1

HDS

TTM2

DND1

CHL1

DMR6-1

DMR6-2

2022

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Устойчивость к биотическим стрессам

eIF4E

2022

Трансфекция протопластов

CRISPR/Cas9

Устойчивость к биотическим стрессам

eIF4E

2022

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Методология

GFP

2022

Трансформация A. rhizogenes листовых эксплантов и сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Методология

HLH47

2022

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas13

Устойчивость к биотическим стрессам

PI, HC-Pro, P3, CI1, CI2, VPg

2023

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Устойчивость к биотическим стрессам

NRL1

2023

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Методология

PDS

2023

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля и листьев

CRISPR/Cas9

Методология, качество клубней

GBSS

2023

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Методология, качество клубней

GBSS

SBE

2023

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Качество клубней

FtsZ1

2023

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

TALEN

Методология, изменение метаболизма

SSR2

2023

Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля

CRISPR/Cas9

Методология, изменение метаболизма

Like3

2023

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Качество клубней

VInv

AS1

2024

Трансфекция протопластов

CRISPR/Cas9

Методология

F3H

2024

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Устойчивость к абиотическим стрессам

DMR6-1

2024

Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов

CRISPR/Cas9

Качество клубней

Pain-1 (VInv1)

В настоящее время большая часть работ, посвященных геномному редактированию картофеля выполнена с использованием системы CRISPR/Cas9 (Табл.1). В 30-ти известных нам работах для индукции мутаций использовали CRISPR/Cas9, тогда как только в 8-ми исследованиях для этого применяли систему TALEN, что является следствием того, что эффективность последней обычно ниже, при этом конструирование TALEN инструментов более трудоемко. Что касается типа экспланта, используемого для получения геномно отредактированных регенерантов картофеля, то листовые и стеблевые сегменты растений in vitro используются в одинаковой мере, часто (Табл.1) в зависимости от предпочтений в той или иной лаборатории. Только в исключительных случаях для этого использовали меристемы

,
или клубневые диски
.

4. Основные направления редактирования генов картофеля

Поскольку основной целью культивирования картофеля является получение клубней, то модификация признаков, так или иначе связанных с клубнями, является одним из главных направлений геномного редактирования. Анализ литературы показывает, что изменению состава крахмала и размера крахмальных гранул, содержанию гликоалкалоидов, а также улучшению ряда послеуборочных признаков, таких как побурение или холодовое пожелтение, уделялось особое внимание (Табл. 1). Целый ряд исследований посвящен редактированию генов, вовлеченных в биосинтез крахмала, в частности гранул связанной синтазы GBSS и крахмал-ветвящего фермента SBE. Так, нокаут генов GBSS в ряде исследований

,
,
,
позволил получить картофель, не содержащий амилозу (разновидность крахмала) в клубнях. Такой картофель, содержащий только разновидность крахмала амилопектин, может найти промышленное применение для производства бумаги, клея, текстиля и биопластиков, а также позволит получать больше этанола без дополнительных затрат. Размер крахмальных зерен имеет значение при переработке и хранении клубней. Показано, что гранулы крахмала меньшего размера разлагаются быстрее, тогда как клубни с большими гранулами крахмала, более подходят для длительного хранения. В работе
путем индуцирования мутаций в гене тубулиноподобной ГТФазы FtsZ1, контролирующего деление пластид, из-за нарушения деления и образования «макропластид», были получены растения, содержащие в клубнях крахмальные гранулы большего размера.

Поскольку картофель относится к семейству Пасленовых, в большинстве его тканей накапливаются стероидные гликоалкалоиды α-соланин и α-чаконин, которые придают горький вкус и токсичны для человека при больших концентрациях. Одной их групп исследователей удалось снизить в клетках картофеля содержание гликоалкалоидов благодаря нокауту 2-оксоглутарат-зависимой диоксигеназы (16DOX), которая катализирует 16α-гидроксилирование (22S)-22,26-дигидроксихолестерина на более поздней стадии биосинтеза гликоалкалоидов

. В другом исследовании уровень токсичных метаболитов (соланин и чаконин) был значительно понижен в клубнях картофеля благодаря нокауту гена редуктазы боковой цепи стерола SSR2
,
.

Клубни растений, у которых были внесены мутации в последовательность гена вакуолярной инвертазы (VInv, Pain-1), демонстрировали низкий уровень редуцирующих сахаров, образующихся в результате долговременного холодового хранения, что позволяет снизить потемнение картофельных чипсов во время жарки и понизить содержание в них акриламида

,
,
,
. С этой же целью были внесены мутации в ген вакуоляряной амилазы (BAM1), однако данные об улучшении качества клубней пока не были представлены
. Недавнее мультиплексное редактирование генов, кодирующих аспарагинсинтетазу 1 (AS1) также продемонстрировало возможность существенно снизить окрашивание картофельных чипсов и содержание акриламида после жарки благодаря значительному уменьшению содержания глюкозы и фруктозы в длительно хранящихся клубнях
.

Серьезной проблемой, как для производителей, так и для потребителей картофеля является ферментативное потемнение тканей, которое происходит при разрезании клубней, а также при их повреждении во время сбора урожая, и послеуборочных операций, таких как транспортировка, хранение и сортировка. Сейчас этот нежелательный процесс контролируется на производстве с помощью химических или физических агентов. В настоящий момент опубликованы работы, в которых с помощью системы CRISPR/Cas9 внесли мутации в гены, кодирующие ферменты полифенолоксидазы (PPO1 и PPO2), участвующие в потемнении тканей картофеля

. Благодаря индукции нокаутных мутаций во всех четырех аллелях гена PPO2 удалось снизить ферментативное потемнение клубней на 73%
.

В работах, направленных на улучшение агрономических свойств растений картофеля, повышение устойчивости к различным абиотическим и биотическим стрессам также является важной темой для исследований. Существует ряд публикаций, в которых различные инструменты редактирования генов использовали для повышения устойчивости растений к вирусам, раннему и позднему фитофторозу картофеля, а также устойчивости к солевому и осмотическому стрессу (Табл. 1). 

Вирус Y картофеля (PVY), относящийся к семейству Потивирусов, распространен по всему миру, имеет широкий круг хозяев, включающий культивируемые виды пасленовых и множество сорняков, и является одним из самых вредоносных патогенов картофеля, наносящих серьезный ущерб при возделывании, а также в семеноводческих хозяйствах

. Известно, что данный РНК-геномный фитовирус использует для репликации и размножения эукариотический комплекс инициации трансляции клеток хозяина 4F (eIF4F), поэтому индукция мутаций во всех аллелях гена eIF4E, входящего в этот комплекс, позволила предотвратить распространение инфекции и существенно повысить устойчивость растений к штаммам PVYи PVYNTN
,
. Помимо внесения мутаций в гены картофеля, предложена стратегия внесения в геном картофеля СRISPR/Cas13 инструментов, направленных на нокаут нескольких генов вируса Y, что позволило получить трансгенные растения, устойчивые к заражению штаммами PVYN, PVYO, и PVYNTN
. Также, было показано, что внесение мутаций в белок коилин, может повысить устойчивость
.

Фитофтороз – самое серьезное грибное заболевание картофеля во всем мире, вызываемое оомицетом Phytophthora infestans. В одном из исследований функциональный нокаут двух из семи предполагаемых генов чувствительности к патогену StDMR6-1 и StCHL1 привел к уменьшению очагов поражения листьев картофеля фитофторозом

. В другом исследовании получены неоднозначные результаты, поскольку мутантные линии с четырехаллельным нокдауном гена StNRL1, демонстрируя повышение устойчивости к P. infestans, оказались восприимчивы к другому патогену, Alternaria alternata
.

Что касается исследований связанных с устойчивостью растений картофеля к абиотическому стрессам, то еще в одной из первых работ по геномному редактированию картофеля была предпринята попытка нокаутировать ген транскрипционного фактора MYB44, регулирующего транспорт фосфатов, подавляя экспрессию PHOSPHATE1 в картофеле

. В недавней работе, растения картофеля у которых были индуцированы мутации в гене DMR6-1 проявляли большую толерантность к засоленным условиям и поддерживали более высокую скорость роста по сравнению с контрольным генотипом
.

5. Заключение

Исследования, связанные с геномным редактированием картофеля, проводятся всего десять лет. За этот короткий срок выявлены и исследованы факторы, влияющие на эффективность геномного редактирования картофеля, а также продемонстрирована возможность получения растений с измененными генами, не несущими вставки последовательностей инструментов геномного редактирования. Уже получены экспериментальные линии картофеля с повышенной устойчивостью к действию биотических и абиотических стрессовых факторов, а также с улучшенными свойствами клубней. С каждым годом растет число новых работ, адресованных методологическим и практическим аспектам применения систем геномного редактирования картофеля. Их дальнейшее развитие открывает широкие перспективы совершенствования картофеля с целью получения высокопродуктивных сортов обладающих востребованными качествами клубней.

Article metrics

Views:109
Downloads:2
Views
Total:
Views:109