BIODEGRADATION OF THE CHLORACETAMIDE HERBICIDE BUTACHLOR BY THE WHITE-ROT FUNGUS TRAMETES HIRSUTA LE-BIN 072
BIODEGRADATION OF THE CHLORACETAMIDE HERBICIDE BUTACHLOR BY THE WHITE-ROT FUNGUS TRAMETES HIRSUTA LE-BIN 072
Abstract
Butachlor is a chloracetamide pre-emergence herbicide with a half-life of up to 29 days, which persists in the environment and has a toxic effect on living organisms. The study evaluated the ability of the white rot-fungus Trametes hirsuta to biodegrade butachlor. It was shown that on the 10th day of incubation of fungal pellets, the residual herbicide content in the culture medium was less than 5% of the initial content (200 mg/l). Analysis of lignolytic enzyme activities showed that the addition of butachlor to the culture medium induced the secretion of both laccase and various class II fungal peroxidases — Mn-dependent peroxidases (MnP) and Mn-independent peroxidases (lignin peroxidase LiP, universal peroxidase VP). The induction of lignolytic peroxidases was higher than that of laccase — activity increased 9- and 15-fold, reaching values of 400 and 35 U/ml for Mn-dependent and Mn-independent peroxidases, respectively. The maximum activity of laccase (120 U/ml) was detected on the third day of incubation, while the maximum activity of peroxidases was observed on the fifth to seventh day. At the end of the cultivation of fungal pellets with herbicide (day 15), a competitive metabolite was detected in the culture medium according to ELISA data. According to in vitro testing using the commercial XenoScreen XL YES Assay kit, the products of butachlor degradation did not exhibit estrogenic activity.
1. Введение
Широкое использование пестицидов в современном сельском хозяйстве не только обеспечило высокую и стабильную урожайность агрокультур, но и привело к попаданию в окружающую среду множества токсичных веществ, загрязняя почву, воду и сельскохозяйственную продукцию. Гербициды являются одним из наиболее широко используемых типов пестицидов, на долю которых приходится около 50% международного рынка пестицидов и которые используются для избирательного уничтожения или подавления роста растений.
Гербициды из химического класса хлорацетанилидов (или хлорацетамидов) (рис. 1) благодаря широкому спектру гербицидных свойств и низкой стоимости, широко применяются для борьбы с однолетними злаковыми и некоторыми двудольными сорняками в посевах многих культур, таких как рапс, подсолнечник, соя, кукуруза и свекла
, . Они вносятся на почву до всходов культуры (с заделкой или без), защищая посевы от сорняков в течение длительного времени. Это обеспечивает эффективную борьбу с сорной растительностью на ранних стадиях роста культурных растений. Эти селективные и системные гербициды подавляют синтез длинноцепочечных жирных кислот, предотвращая нормальный рост проростков сорняков .Ацетохлор и бутахлор являются также очень популярными гербицидами в Азии с нормой расхода около 4,5 × 107 кг в год
, при рекомендуемой дозировке 3000 мл га−1 . На Индию приходится около 6,75 × 106 кг годового использования бутахлора . S-метолахлор применяется в России как селективный довсходовый почвенный гербицид для борьбы с однолетними злаковыми и некоторыми двудольными сорняками на посевах таких культур, как кукуруза, подсолнечник, соя, сахарная свекла, рапс и капуста . В сельском хозяйстве США в 2021 г. было использовано 41,7 млн фунтов ацетохлора согласно данным Министерства сельского хозяйства США (USDA) .
Рисунок 1 - Гербициды из химического класса хлорацетамидов
В связи с вызываемыми неблагоприятными эффектами на окружающую среду и здоровье человека удаление хлорацетамидов из почвы и воды стало ключевым направлением современных исследований. Хотя для обработки пестицидов доступны различные химические и физические процессы, такие как фотоокисление, химический гидролиз и адсорбция, более эффективным подходом являются недорогие и экологически безопасные технологии биоремедиации , . Использование биологических методов удаления пестицидов способствуют также восстановлению качества почвы и повышают ее плодородие .
Биоремедиация, опосредованная грибами, или микоремедиация, является инновационной многообещающей технологией очистки окружающей среды от экотоксикантов, благодаря своей экономической эффективности, экологичности и универсальности . В последние годы детоксикация загрязненных земельных и водных ландшафтов путем применения одного или нескольких видов грибов в качестве природных агентов привлекает внимание ученых как эффективный инструмент для восстановления окружающей среды. По сравнению с другими микроорганизмами, грибы могут не только быстро поглощать ксенобиотики и выживать в условиях с недостаточным содержанием питательных веществ, кислых значениях pH, низком содержании воды, но и продуцировать различные внеклеточные ферменты, которые могут взаимодействовать с различными поллютантами с высокой степенью неспецифичности. Таким образом, разнообразие грибов и их способность вырабатывать широкий спектр специфических и неспецифических ферментов делают грибы идеальными кандидатами для борьбы с широким спектром загрязняющих веществ. Они могут быть эффективны в очистке in situ или ex situ от различных загрязняющих веществ, таких как тяжёлые металлы, красители, гербициды и фармацевтические препараты , , , .
В данной работе была проведена оценка способности гриба белой гнили Trametes hirsuta к биодеструкции хлорацетамидных гербицидов на примере бутахлора.
2. Методы и принципы исследования
Пеллеты гриба белой гнили Trametes hirsuta LE-BIN 072 из Коллекции культур базидиомицетов LE-BIN Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской академии наук (Санкт-Петербург, Россия) культивировали на минеральной среде следующего состава (г/л): KH2PO4 — 0.6; K2HPO4 — 0.4; MgSO4•7H2O — 0.5; CaCl2 — 0.05; MnSO4 — 0.05; ZnSO4 — 0.001; FeSO4 — 0.0005; NaNO3 — 3.0; глюкоза — 10.0. Перед внесением грибных пеллет (из расчета 10 г сырой биомассы на 100 мл ростовой среды) в опытные колбы добавляли бутахлор в концентрации 200 мг/л, инкубировали в течение 15 суток на роторной качалке при 100 об./мин и 25°C. В ходе инкубации проводился отбор проб культуральной среды, в которых определяли остаточное содержание бутахлора и активность лигнолитических ферментов.
Определение остаточного содержания бутахлора (N-(бутоксиметил)-2-хлор-N-(2,6-диэтилфенил)ацетамид) в ростовой среде в процессе инкубации грибных пеллет (рис. 2) проводили методом ВЭЖХ и конкурентного ИФА, для чего готовили экстракты образцов культуральной жидкости на разных стадиях культивирования гриба и деградации бутахлора в дихлорметане (ДХМ) — 1:1 (об./об.). Затем экстракты упаривали, осадок перерастворяли в эквивалентном объеме 10 мМ ФБС с 20% метанола, далее растворы либо разбавляли 10 мМ ФБС с 20% метанола в 10 раз, либо использовали неразбавленными. ИФА проводился по методике с модификациями.
Для проведения ИФА конъюгат БСА и производным бутахлора с концентрацией 1.0 мкг/мл в 10 мМ ФБС сорбировали в лунки микропланшета в течение ночи при 4°C. Затем микропланшет три раза промывали ФБС, содержащим 0.05% Твин-20 (ФБСТ). После стадии иммобилизации и промывки микропланшета в лунки вносили 50 мкл растворов бутахлора в соответствующей среде — либо 10 мМ ФБС с 20% метанола (концентрации в диапазоне 20000–0.12 и 0 нг/мл), либо восстановленной в том же буфере пробы, а также 50 мкл антисыворотки (разведение 1:9000). Концентрации и разведения конечные в лунках. Затем микропланшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После отмывки ФБСТ добавляли антивидовые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (разведение препарата 1:3000). После промывки (три раза ФБСТ и один раз дистиллированной водой) определяли активность ферментной метки, связавшейся с носителем, добавляя 100 мкл раствора субстрата (коммерческий раствор ТМБ+H2O2) и останавливая реакцию через 15 мин добавлением 50 мкл 0.1 М H2SO4. Оптическую плотность измеряли при 450 нм и строили график зависимости оптической плотности от концентрации бутахлора с использованием программного обеспечения Origin 9.0 (OriginLab, США).
Рисунок 2 - Фото грибных пеллет гриба белой гнили Trametes hirsuta
Анализ эстрогенной активности метаболитов бутахлора in vitro проводили с использованием коммерческого набора XenoScreen XL YES Assay kit (Xenometrix, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. В тесте YES используется рекомбинантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащий плазмиду с рецептором человеческого эстрогена hERα, связанным с геном lacZ, который кодирует β-галактозидазу . Затем реакция на химическое вещество или смесь измеряется с помощью субстрата для β-галактозидазы, продукт которой приводит к цветному или флуоресцентному сигналу. Взаимодействие рецептора hERα с молекулой лиганда модулирует транскрипцию репортерного гена lacZ и продукцию β-галактозидазы, которая, взаимодействуя с субстратом (хлорфенол красный-β-D-галактопиранозид, CPRG) приводит к образованию окрашенных продуктов. Измеряемая оптическая плотность при длине волны 570 нм напрямую коррелирует с количеством секретируемой β-галактозидазы и, следовательно, с активностью тестируемого вещества, связывающегося с рецептором эстрогена hERα.
Все эксперименты проводились в 3-х биологических повторах и с использованием соответствующих градуировочных кривых.
3. Основные результаты
Была изучена способность дереворазрушающего гриба белой гнили Trametes hirsuta LE-BIN 072 к биодеструкции гербицида бутахлора. Рекомендуемая полевая доза внесения хлорацетамидных гербицидов составляет 5–10 мг/кг , . В соответствии с литературными данными , , в предварительном эксперименте по влиянию гербицида на рост грибной биомассы были взяты следующие концентрации бутахлора — 10 мг/л (1×), 50 (5×), 100 (10×) и 200 (20×) мг/л. Результаты эксперимента показали, что даже при 20-ти кратном увеличении рекомендуемой дозы рост гриба не ингибировался. Количество сырой биомассой в конце инкубации (15 суток) было сопоставимо с таковой при культивировании грибных пеллет на контрольной среде без гербицида и составляло около 100 г/л сырой биомассы. Действительно, в условиях полевых экспериментов было продемонстрировано, что при внесении в почву 10-и кратных норм применения различных пестицидов (как в смеси, так и по отдельности), численность представителей отдела Basidiomycota в грибных сообществах увеличивалась, то есть ингибирующий эффект на рост базидиомицетов отсутствовал . В дальнейших экспериментах по изучению биодеструкции гербицида грибом T. hirsuta концентрация бутахлора в ростовой среде составляла 200 мг/л.
В процессе инкубирования грибных пеллет отбирали образцы культуральной жидкости (КЖ) и определяли в них концентрацию бутахлора с использованием двух независимых аналитических методов — ВЭЖХ и ИФА (рис. 3 и 4).
Рисунок 3 - Динамика убыли содержания бутахлора в образцах культуральных жидкостей, отобранных в разные дни инкубирования пеллет Trametes hirsuta. Концентрация бутахлора определена методом ВЭЖХ
Рисунок 4 - Гистограмма, демонстрирующие убыль бутахлора в образцах культуральных жидкостей (черные столбцы) и возрастание количества конкурирующего в ИФА продукта деградации бутахлора (красные столбцы)
Рисунок 5 - Корреляционная кривая, полученная по результатам тестирования проб, полученных методами ВЭЖХ и ИФА
Динамика изменения активностей лигнолитических ферментов в процессе инкубирования грибных пеллет на контрольной минеральной среде и на этой же среде с внесением бутахлора представлена на рисунке 6. Показано, что внесение бутахлора в среду культивирования сильно индуцировало секрецию как лакказ, так и грибных пероксидаз — Mn-зависимых пероксидаз (MnP) и Mn-независимых пероксидаз. По сравнению с лакказами, индукция лигнолитических пероксидаз была выше — активность возрастала в 9 и 15 раз для MnP и Mn-независимых пероксидаз соответственно. При этом максимальная активность лакказы детектировалась на 3-й сутки культивирования, тогда как максимальная активность пероксидаз наблюдалась на 5–7-й день.
Рисунок 6 - Динамика ферментативных активностей в культуральной среде гриба Trametes hirsuta:
а – лакказная активность (субстрат АБТС); б – активность Mn-зависимых пероксидаз (субстрат Mn2+); в – активность Mn-независимых пероксидаз (субстрат вератровый спирт)
4. Обсуждение
С использованием 2-х аналитических методов ВЭЖХ и конкурентного ИФА показано, что содержание бутахлора в культуральной среде снижается более эффективно в первые 2 дня инкубирования грибных пеллет T. hirsuta (рис. 3 и 4), что может быть связано с эффективной сорбцией бутахлора на грибном мицелии в первые сутки культивирования. Последующее более медленное снижение содержания бутахлора в образцах КЖ может быть опосредовано секрецией грибом лигнолитических ферментов (рис. 6), участвующих в биодеградации гербицида. Так, на 3-и сутки инкубирования отмечено значительное возрастание активности лакказы на среде с бутахлором (рис. 6а). Недавно было высказано предположение, что лакказа может играть значительную роль в деградации как бутахлора, так и других хлорацетамидных гербицидов . Дальнейшее инкубирование грибных пеллет в присутствии гербицида приводило к значительной индукции пероксидазной активности (рис. 6б и 6в). Аналогичная динамика ферментативных активностей T. hirsuta была продемонстрирована при биодеградации грибом соединения эфира фталевой кислоты DiBP . При этом анализ секретомов гриба T. hirsuta показал увеличение продукции основных ферментов лигнолитического комплекса гриба, таких как лакказы и грибные пероксидазы II класса, в том числе MnP, LiP и VP . Хорошо известно, что ферменты лигнолитического комплекса грибов участвуют в деструкции различных ксенобиотиков, как-то полиароматические углеводороды ПАУ, различные красители и антибиотики, эфиры фталевой кислоты и ряд других . Ранее было показано, что лигнолитические ферменты гриба T. hirsuta участвуют в биодеградации красителя RBBR , эфиров фталевой кислоты , .
В конце инкубирования (на 15 сутки) наблюдался эффект, при котором по результатам ВЭЖХ анализа бутахлор в КЖ содержался в следовых количествах (рис. 3), однако по данным ИФА наблюдалась выраженная конкуренция за связывание антител (рис. 4). Вероятно, в результате деградации бутахлора грибом T. hirsuta в культуральной среде образуется конкурирующий метаболит, распознаваемый антителами. До недавнего времени было известно только о трёх штаммах почвенных грибов (Fusarium solani и F oxysporum, Chaetomium globosum) способных разлагать бутахлор . Процессы разложения бутахлора почвенными грибами в основном включают дехлорирование, гидроксилирование, дегидрирование, дебутоксиметилирование, деалкилирование и циклизацию. Среди образующихся метаболитов были обнаружены 2-хлор-N-(2,6-диэтилфенил)-N-метилацетами; 2-хлор-N-(2,6-диэтилфенил)ацетамид; N-(2,6-диэтилфенил)ацетамид; 2,6-диэтиланилин и др.
Тестирование in vitro показало отсутствие эстрогенной активности в образцах КЖ после биодеструкции. Необходимо проведение дальнейшего более детального изучения механизма биодеструкции хлорацетамидных гербицидов грибом белой гнили T. hirsuta.
5. Заключение
Доказано, что микроорганизмы и их ферменты эффективны в биодеградации хлорацетамидных гербицидов, включая бутахлор. В некоторых исследованиях изучались пути микробной деградации бутахлора, но механизмы его деградации всё ещё требуют дальнейшего систематического изучения, в особенности, что касается грибных генов и ферментов, связанных с деградацией данного гербицида. В настоящем исследовании показано, что дереворазрушающий гриб белой гнили Trametes hirsuta способен эффективно разрушать бутахлор. В процессе биодеструкции задействован комплекс лигнолитических ферментов гриба, таких как лакказы и пероксидазы. Образующиеся при этом метаболиты бутахлора не обладают эстрогенной активностью.