EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF CASEINIC PROTEIN GENES AND LIPID METABOLISM GENES IN SIMMENTAL COWS
EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF CASEINIC PROTEIN GENES AND LIPID METABOLISM GENES IN SIMMENTAL COWS
Abstract
This work presents a study of genetic diversity in kappa-casein (CSN3), beta-casein (CSN2), 1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase and Sterol-CoA desaturase 1 (SCD1) genes of cows of Simmental breed. Ear pluck samples for genotyping were obtained from Orel region. The research was carried out using PCR with hybridisation-fluorescence detection in "real time" mode according to the methods developed and optimized by us. As a result, we determined the frequencies of alleles and genotypes of the studied genes. No Hardy-Weinberg deviation was observed for the AGPAT6, CSN3 and CSN2 genes, while a shift in genetic balance was detected for the SCD1 gene.
1. Введение
Оценка факторов, влияющих на изменчивость технологических свойств молока, может являться критерием, по которому возможен отбор животных в селекционном процессе. К таким факторам зачастую относят породу, условия кормления, возраст и генотип животного. Влияние технологических свойств на производственные процессы, такие как производство сливочного масла, молочных консервов или выработка сыра зависит от содержания основных компонентов молока – % жира и % белка, соотношения ненасыщенных и насыщенных жирных кислот, термостабильности и способности к сычужному свертыванию , , , . Учёт при подборе животных их генотипов по селекционно-значимым генам позволит создавать стада, производящие молоко с оптимальными для его переработки характеристиками , особенно для симментальской породы, молоко которой по содержанию % жира и % белка является максимально оптимальным для промышленного использования.
Из имеющихся технологических свойств возможно контролировать и улучшать насыщенность жирных кислот, термостабильность и сычужное свертывание с применением маркерной-селекции. Влияние таких генов, как 1-ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза (AGPAT6) и Стерол-CoA десатураза 1 (SCD1) принято ассоциировать с массовой долей жира и его насыщенностью , , , а аллельные полиморфизмы по генам каппа- и бета-казеина с массовой долей белка, и соответственно, с термостабильностью и выходом творога и сыра , , . Таким образом, целью нашей работы было установление генетического разнообразия по генам казеиновых белков – каппа- и бета казеина и генам липидного обмена – AGPAT6 и SCD1 у коров симментальской породы.
2. Методы и принципы исследования
Исследования проводились на животных симментальской породы (n=298) (Орловская область). Геномная ДНК выделялась с использованием набора «ДНК-Экстран-2» производства НПО «СИНТОЛ» из выщипов ушных раковин.
Реакцию амплификации проводили в 15 мкл смеси ПЦР, содержащей 3 мкл реактива qPCRmix-HS («Евроген», Россия), по 3 pМ прямого и обратного праймеров, и аллель-специфичных ДНК-зондов (таблица1) и 10 нг ДНК.
Таблица 1 - Последовательности используемых олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зондов
Каппа-казеин (CSN3) | |
CSN3_F: 5’- AGA GCC CAC CTG AGA TCA AC-3’ CSN3_R: 5’-TCT TGG CTG TTA TTC ATT TTG C-3’ CSN3_B: 5’-FAM-CAA CTG CGG TCT AAA TAC TCT AAG GAG-BHQ1-3’ CSN3_A: 5’-HEX-CAA CTG CAG TCT AAA AAC TCT AAG GAG-BHQ1-3’ | |
Бета-казеин (CSN2) | |
CSN2-f: 5’-CTT TGC CCA GAC ACA GTC TCT AGT-3’ CSN2-r: 5’-GCA CCA CCA CAG GGG TT-3’ CSN2_A1: 5’-FAM-CTG GAC CCA TCC ATA ACA GCC TCC C-BHQ1-3’ CSN2_A2: 5’-HEX-TGG ACC CAT CCC TAA CAG CCT CCC-BHQ1-3’ | |
1-ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза (AGPAT6) | |
AGPAT6-F: 5′-CCA GAA AGG CTG GAG GAG TT-3′ AGPAT6-R: 5′-ATT CCC AGA AGC ACA GTT TAG T T-3′ AGPAT6_G: 5′-FAM-CAA GAA AAT GTG ACG GTA-BHQ1-3′ AGPAT6_T: 5′-HEX-CAA GAA AAT TTG ACG GTA T-BHQ1-3′ | |
Стерол-CoA десатураза 1 (SCD1) | |
SCD1-F: 5'-CCC TTA TGA CAA GAC CAT CAA CC-3' SCD1-R: 5'-GAC GTG GTC TTG CTG TGG ACT-3' SCD1-T: 5'-FAM-CTT ACC CAC AGC TCC CA-BHQ1-3' SCD1-С: 5'-HEX-TAC CCG CAG CTC CC-3-BHQ1 |
ПЦР в «реальном времени» генов проводили с помощью прибора Bio-Rad CFX96 в оптимизированных условиях: для AGPAT6 и SCD1: 37 °C – 5 мин.; 95 °C – 10 мин.; 95 °C – 20 сек., 55 °C – 30 сек., 72 °C 20 сек., 40 циклов, для CSN3 и CSN2: 37 °C – 5 мин.; 94 °C – 5 мин.; 94 °C – 15 сек., 60 °C – 60 сек., 40 циклов. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и HEX. Аллельная дискриминация оценивалась посредством программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.
Описательные статистические параметры (среднее арифметическое, ошибка, стандартное отклонение) вычислялись при помощи пакета «Анализ данных» в среде MSExcel 2013.
3. Основные результаты
По итогам генотипирования были идентифицированы по 3 генотипа каждого из исследуемых генов (таблица 2).
Таблица 2 - Частоты аллелей и генотипов генов SCD1 и AGPAT6 у голштинизированного черно-пестрого скота опытного хозяйства
| Частоты генотипов | Частоты аллелей | χ2 | p-value | |||
SCD1 | TT | TC | CC | T | C | 6,2 | 0,045 |
0,215 | 0,415 | 0,37 | 0,42 | 0,58 | |||
AGPAT6 | GG | GT | TT | G | T | 2,0 | 0,37 |
0,418 | 0,425 | 0,157 | 0,63 | 0,37 | |||
CSN3 | AA | AB | BB | A | B | 2,4 | 0,3 |
0,54 | 0,36 | 0,1 | 0,72 | 0,28 | |||
CSN2 | A1A1 | A1A2 | A2A2 | A1 | A2 | 0,8 | 0,68 |
0,15 | 0,44 | 0,41 | 0,37 | 0,63 | |||
В рамках исследуемой выборки симментальских коров минимальные частоты встречаемости были выявлены у генотипов ТТ гена SCD1 – 0,215 и AGPAT6 – 0,157, генотипа ВВ гена каппа-казеина – 0,1 и генотипа A1A1 гена бета-казеина. Частоты встречаемости каждого аллеля равномерно распределялись по выборке. Отклонений фактического распределения частот генотипов от теоретического согласно закону Харди-Вайнберга не наблюдалось, кроме гена SCD1, где нами было выявлено смещение равновесия.
Стерол-СоА десатураза 1 является одним из ключевых ферментов, играющих важную роль в синтезе и метаболизме жирных кислот, т.к. отвечает за образование двойной связи между 9 и 10 атомами углерода и превращением средне- и длинноцепочечных жирных кислот в их ненасыщенные аналоги. Ген SCD1, кодирующий соответствующий фермент, располагается на 26 бычьей хромосоме и у него обнаружены SNP в 3´ нетранслируемой области и 5-м экзоне. В исследуемом полиморфизме c.878C>T в 3-м экзоне рядом работ показаны ассоциации аллеля С с такими признаками продуктивности, как массовая доля жира и белка , , а также содержание мононенасыщенных жирных кислот , , . Интерес к исследованию данного гена проявляется, в первую очередь, из-за его влияния на содержание ненасыщенных жирных кислот, что отражается на качестве молочной и мясной продукции, а также снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний . По этой причине исследования полиморфизма SCD1 проводились в основной массе на голштинской , и мясных породах , , а среди отечественных исследователей на голштинской , голштинизированной черно-пестрой и айширской . Согласно вышеуказанным исследованиям, общей особенность данного гена являлась низкая частота встречаемости аллеля Т (0,07 – 0,27) и, соответственно, гомозиготного генотипа ТТ (0,05 – 0,16). В противовес указанным данным, в нашем исследовании по симментальскому скоту частоты встречаемости аллельных вариантов гена SCD1 оказались практически одинаковыми Т – 0,42, С – 0,57, а самым распространенным генотипом – гетерозиготный СТ – 0,415. Выявленное отклонение распределения частот возможно связано с давлением отбора вследствие того, что молоко симментальских коров является оптимальным по соотношению содержания жира и белка для сыроварения и переработки, а SCD1 отвечает за содержание ненасыщенных жирных кислот, влияющих на тягучесть молочного жира. Но данное утверждение требует более детального анализа аллельного полиморфизма SCD1 на взаимосвязь с технологическими свойствами молока.
AGPAT6, располагающийся на 27 бычьей хромосоме, является наиболее экспрессируемой изоформой ферментов семейства 1-ацилглицерин-3-фосфатацилтрансфераз (AGPATs) в молочной железе крупного рогатого скота в период лактации. Принято считать, что он связан с показателем жирномолочности и оказывает существенное влияние на синтез тригицеридов, катализируя присоединения ацильных групп к глицерин-3-фосфату . Также показано, что нокдаун данного гена приводит к существенным изменениям в содержании триглицеридов и размерах липидных капель в молоке , а некоторые SNP в промотерной зоне влияют на его сплайсинг и получение редуцированных форм фермента . Полученные нами результаты показывают о снижении частоты гетерозиготности – 0,425, в пользу увеличения гомозиготного генотипа GG – 0,418 у коров симментальской породы в сравнении с голштинизированной черно-пестрой породой, где преобладал гетерозиготный генотип – 0,51 .
Бета – и каппа-казеины, составляющие основную массу казеиновых белков в молоке, кодируются одноименными генами – CSN2 и CSN3, располагающимися на 6-й бычьей хромосоме. Казеиновые белки, играющие основную роль в коагуляции молока, позволяют оценивать аллельный полиморфизм их генов как влияние на технологические свойства молока и пригодность к сыроварению [5]. В дополнение этому, в последние десятилетия, бета-казеин рассматривается с точки продовольственной безопасности, а именно, влияние А1-изоформы белка как пищевого аллергена . Аллель В гена каппа-казеина, ассоциированная с повышенным содержанием белка в молоке, а также лучшими коагуляционными свойствами молока, имеет низкую частоту встречаемости у голштинской и голштинизированной черно-пестрой породы, как и у отечественных пород, так и иностранной селекции – 0,3, что обеспечивается за счет гетерозиготного генотипа АВ, т.к. гомозиготный генотип ВВ может встречаться не во всех популяциях или с очень низкой частотой – 0,09 . Распределение генотипов CSN3 в симментальской породе в большей степени аналогично голштинской и превалирует А-аллель CSN3 – до 0,72 . Результаты, полученные в нашем исследовании можно считать идентичными, т.к. частота встречаемости аллеля В и генотипа ВВ, составили – 0,28 и 0,1, соответственно.
Ситуация с приоритетным аллелем А2 гена бета-казеина значительно отличается от аллеля В каппа-казеина. Являясь аллелем «дикого типа», а также в результате активного продвижения тренда на «здоровое молоко А2», частота встречаемости данного аллеля (0,6-0,65), а также гомозиготного генотипа А2А2 (0,4) значительно превосходит аллель А1 и генотип А1А1 – 0,3-0,37 и 0,14, соответственно , , . Сопоставимые результаты были получены нами на симментальской породе: А2 – 0,63; А2А2 – 0,41.
Анализ межгенного взаимодействия показал наличие 64 комбинированных генотипа из 81 возможных с частотами встречаемости от 0,4% до 4,8%. Среди казеиновых белков максимальные частоты встречаемости у комбинированных генотипов (CSN3-CSN2) были у ААА1А2-25,9% и ААА2А2-20%, лучшие же генотипы ВВА2А2 и АВА2А2 встречались значительно реже – 5,2% и 14,3%, соответственно. Наиболее распространёнными комбинированными генотипами у генов липидного обмена (AGPAT6-SCD1) являлись GTCT– 20,3%, при этом наилучший вариант генотипа по продуктивности GGCT был вторым по распространенности – 18,3%.
4. Заключение
В рамках данной работы рассмотрено генетическое разнообразие по генам липидного обмена и казеиновым белкам молока у коров симментальской породы. Распределение частот встречаемости для гена SCD1 составило ТТ-0,215, ТС-0,415, СС-0,37; для гена AGPAT6 составило GG-0,418, GT-0,425, TT-0,157; для гена CSN3 составило АА-0,54, АВ-0,36, ВВ-0,1 и для гена CSN2 А1А1-0,15, А1А2-0,44 и А2А2-0,41. Наиболее часто встречаемые генотипы среди генов казеиновых белков были ААА1А2, а среди генов липидного обмена – GTCT.
Использование полученных данных позволит провести дальнейшие исследования по оценке влияния аллелей исследуемых генов на продуктивность и жирнокислотный состав молока с использованием смешанных моделей в рамках методологии BLUP, а также с применением вложенных факторов, в которых генотип будет являться элементом такого фактора.