ЛЕСОПАТОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ НАСАЖДЕНИЙ СОСНЫ СИБИРСКОЙ КЕДРОВОЙ В ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ

Впервые в Иркутской области заболевание сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) бактериальной водянкой было отмечено в 2012 году, когда были обнаружены очаги усыхания в кедровых насаждениях. Результаты государственного лесопатологического мониторинга показали, что в настоящий момент площадь кедровых лесов, поврежденных этим заболеванием в Иркутской области, составляет более 51 тыс. га, усохло из них более 5,7 тыс. га. Симптомами бактериальной водянки хвойных являются ослабление и усыхание деревьев, поперечные и продольные трещины в коре и активное смолотечение из них, наличие на поперечном срезе древесины ствола «мокрого ядра», а у сильно ослабленных и недавно усохших деревьев – характерного «темного водослоя». Установлено, что основной причиной заболеваний является поражение бактерией (Erwinia nimipressuralis Carter.) на фоне неблагоприятных абиотических факторов

Для точного установления причин усыхания насаждений сосны сибирской кедровой и решения их последствий исследования должны включать целый спектр методов. К ним относятся лесопатологические (мониторинг фитосанитарного состояния лесов), молекулярно-генетические (высокоточная диагностика болезней и вредителей) и биоинформационные (космический мониторинг состояния лесов, прогнозирование развития неблагоприятных сценариев с использованием нейронных сетей и др.). Однако проведенные исследования в Иркутской области не подтвердили наличия возбудителя водянки – Erwinia nimipressuralis Carter.

Леса Байкальской природной территории выполняют важные экологические функции: водоохранную, водорегулирующую, противоэрозионную, средообразующую, а также имеют большое народно-хозяйственное значение как совокупность биологических ресурсов: древесины, лесных пищевых и лекарственных растений, грибов, промысловых зверей, птиц и других. Все в совокупности указывает, насколько важную роль играют леса БПТ в сохранении озера Байкал. Учитывая сокращение площади лесов в результате промышленной эксплуатации, пожаров, экстремальных природно-климатических явлений, массового размножения насекомых вредителей и распространения болезней необходимо тщательное планирование для организации государственного лесопатологического мониторинга и мероприятий по защите леса. Крайне актуально для этого использование современных научных методов, в частности использование методов молекулярно-генетической диагностики путем проведения ДНК анализов для мониторинга состояния лесных генетических ресурсов

В отечественной литературе бактериоз и его возбудитель были впервые описаны в 1963 г. А.Л. Щербин-Парфененко на 22 видах хвойных и лиственных пород, который и дал название болезни – бактериальная водянка

Актуальность молекулярно-генетического метода исследования заключается в точности видового определения фитопатогенов, что важно для организации лесопатологического мониторинга, определения сроков надзора за вредным организмом, применения средств защиты растений от него, прогнозирования распространения и оценки вредоносности.

Появление технологий ДНК-маркирования позволило выполнять идентификацию фитопатогенов на качественно новом уровне. Во-первых, для ДНК-анализа требуется небольшое количество исследуемого материала (несколько миллиграмм). Во-вторых, выбор универсальной пробы или специфических праймеров позволяют выявлять ДНК возбудителя в образце в любом ее количестве и стадии инфицирования.

Среди видов ДНК анализа, ПЦР-технологии (PCR) занимают ведущее место в анализе ДНК фитопатогенов. Важным этапом анализа является построение специфических праймеров (SCAR), позволяющих диагностировать определенный вид возбудителей инфекции. Однако в настоящее время для большинства видов патогенов абсолютно специфичные праймеры отсутствуют либо работают некорректно. Это связано с высоким уровнем наследственной изменчивости микроорганизмов, что приводит к ошибочным результатам – выявлению близкородственных видов в образцах. Увеличение разрешающей силы SCAR-диагностики может быть достигнуто дополнительным SSCP- или RFLP-анализами ампликонов

В настоящее время наиболее точным и информативным методом видовой идентификации является секвенирование. Данный тип анализа позволяет производить идентификацию на уровне штаммов. Объектами анализа являются гены рибосомальной РНК, фрагменты митохондриальной ДНК, внутренние транскрибируемые спейсеры рибосомальных генов (ITS). На основании секвенирования данных локусов изучены филогенетические взаимоотношения различных видов фитопатогенов

Цель работы: точное установление причин усыхания насаждений сосны кедровой сибирской с использованием методов молекулярно-генетической диагностики путем проведения ДНК анализов для мониторинга состояния лесных генетических ресурсов.

В Иркутской области сбор биоматериалов сосны сибирской кедровой и пихты сибирской для подтверждения наличия возбудителя бактериальной водянки кедра осуществлялся в Быстринской и Култукской дачах Слюдянского участкового лесничества Слюдянского лесничества, в Шаманской даче Шелеховского участкового лесничества Шелеховского лесничества и в Тойсуковском участковом лесничестве Усольского лесничества.

Объектами исследования являлись:

1. Хвойные виды лесных древесных растений в насаждениях Байкальской природной территории: сосна кедровая сибирская и пихта сибирская, произрастающие в Иркутской области на территории 3 лесничеств: Слюдянского, Шелеховского и Усольского. В качестве экспериментального материала отбирались хвоя и фрагменты древесины (керны). Для дальнейшей транспортировки в отдел мониторинга состояния лесных генетических ресурсов ЦЗЛ Республики Бурятия часть образцов древесины фиксировались в 70% этиловом спирте, другая часть доставлялась в бумажных конвертах.

2. Насекомые-вредители как переносчики грибных и бактериальных заболеваний в лесных насаждениях Байкальской природной территории – 7 образцов: шестизубчатый короед, короед вершинный, смолевка сосновая, древесинник полосатый, личинка черного соснового усача и две неопределенные личинки.

При сборе образцов вначале внимательно осматривалось состояние насаждения на выявление характера и признаков поражения, а именно: раны ствола или ветвей, поперечное и (или) продольное растрескивание коры, наличие потеков смолы, экссудата, суховершинности, изменения окраски ассимилирующего аппарата, наличие масляно-кислого или иного запаха. Все выявленные объекты сбора образцов обязательно документировались путем фотографирования. При этом делали снимки общего вида пораженного очага и один или несколько детальных снимков дерева (деревьев) с признаками поражения и указанием к фото соответствующего номера образца.

Для фитопатологического анализа, проводимого генетическими методами, нельзя отбирать давно погибшие или сильно повреждённые участки растений. В таких образцах уже практически нет ДНК патогенных организмов. Для выяснения причины повреждения или гибели насаждений с помощью ДНК-анализа брались образцы на границе живой и поврежденной частей растения. Для проведения генетического анализа патогенов проводился сбор биологического материала – образцов хвои (листьев), древесины (керны, взятые буравом Пресслера на высоте 1,3-1,5 м), экссудата (высохших инфицированных бактериями потеков) и стволовых вредителей потенциальных переносчиков возбудителей болезней (при их наличии).

В полевых условиях ДНК не может быть получена из свежего образца и образец должен быть сначала помещен на хранение и транспортирован в специализированную лабораторию. Обследованы на наличие возбудителей бактериозов насаждения сосны сибирской кедровой и пихты сибирской. Всего исследовано 506 образцов биоматериала, отобранные с ослабленных деревьев с характерными признаками поражения бактериозом: бурая древесина, растрескивание коры, вздутия вокруг продольных трещин, высохшие подтеки экссудата.

В Иркутской области сбор биоматериалов осуществлялся в Быстринской и Култукской дачах Слюдянского участкового лесничества Слюдянского лесничества, в Шаманской даче Шелеховского участкового лесничества Шелеховского лесничества и в Тойсуковском участковом лесничестве Усольского лесничества. Места сбора образцов для оценки санитарного и лесопатологического состояния лесных генетических ресурсов в очагах бактериальных заболеваний на БПТ за 2023 год представлены в таблице 1.

Все сведения о местах сбора образцов с указанием координат сведены в таблицу 2.

С целью видовой идентификации выявленного спектра грибов было проведено секвенирование полученных ампликонов на генетическом анализаторе 3500 Applied Biosystems. В результате молекулярно-генетической идентификации секвенированных последовательностей в генетической базе данных NCBI определено 7 видов грибов (таблица 3).

Из грибных патогенов, выявленных при исследовании следует отметить следующие:

1. Rhytismataceae – семейство грибов, входящее в порядок Rhytismatales. Представители семейства –паразиты и сапротрофы на листьях и коре растений. Многие виды вызывают пятнистость и преждевременное опадание листьев, иногда – «ведьмины мётлы».

2. Nakazawaea – род дрожжей отряда сахаромицетных. Родство этого таксона с другими таксонами отряда не является полностью неизвестным.

3. Penicillium citreonigrum (ранее – пеницилл цитрусово-зелёный) – вид несовершенных грибов, относящийся к роду пеницилл (Penicillium).

4. Sydowia polyspora (Bref. & Tavel) E. Müll. – возбудитель склероморфоза

С целью идентификации доминирующей бактериобиоты в образцах древесины пихты сибирской и сосны кедровой с признаками бактериозов было проведено секвенирование ПЦР продуктов, полученных с использованием спектра универсальных праймеров. Идентификация секвенированных последовательностей осуществлялась в генетической базе данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, США) с использованием сервиса BLAST. Перечень доминирующих видов, включая виды, идентифицированных с использованием видоспецифических праймеров, представлены в таблице 4.

Значение насекомых в распространении многих бактериальных болезней давно доказано. Высшие растения являются средой, где происходит контакт различных организмов, и в процессе эволюции между ними возникают определенные взаимоотношения. Взаимоотношения между фитопатогенными бактериями и насекомыми определяют степень участия последних в распространении бактериозов в природе

Бактерии могут распространяться, находясь внутри тела насекомого или на его поверхности. Однако у многих насекомых, питающихся растительными тканями, фитопатогенные бактерии попадают в кишечник, но не у всех в кишечном тракте могут размножаться возбудители болезней. Жуки Chactocnema pulicaria являются постоянными носителями Pantoae stewarti. Некоторые виды бактерий заражают яйца насекомых еще в кладках, затем проникают внутрь, выходящие из кладок личинки первого возраста уже обсеменены фитопатогенными бактериями. В данном случае насекомые являются не только переносчиками, но и резерваторами патогенных для растений бактерий. По мнению В.И. Полтева и др.

В процессе обследования лесных насаждений и отборе образцов с симптомами поражения проводили сбор встречающихся насекомых, особенно на пораженных растениях. Для исследования были отобраны насекомые отряда Coleoptera, а также личинки жуков-короедов.

Рисунок 1 - Энтомологические объекты исследования

DOI:10.60797/JAE.2025.55.2.5

В Слюдянском лесничестве Иркутской области были обнаружены короед шестизубый (Ips sexdentatus Boern.), смолевка сосновая (Pissodes pini Linnaeus), древесинник хвойный полосатый (Trypodendron lineatum Oliv.), личинка черного соснового усача (Monochamus gallopovincialis Ol.) и еще две личинки, определить которых не удалось. Из перечисленных видов к опасным вредителям относится только короед шестизубый. Однако и он является вредителем деревьев, метаболические процессы которых необратимо нарушены. Короеды-древесинники и смолевка сосновая, являясь хозяйственно неопасными видами ксилофагов, способны заселять ослабленные деревья, утратившие жизнеспособность, и не заселяют деревья без предварительного их ослабления другими факторами.

Из всех насекомых и личинок была выделена ДНК. В результате молекулярно-генетической идентификации секвенированных последовательностей в генетической базе данных NCBI определено 4 вида бактерий и видов грибов (таблица 5).

Выделенная из смолевки бактерия Pseudomonas cichorii (Swingle) Stapp относится к грамотрицательным бактериям, населяющим почву. Он имеет широкий спектр хозяев и из-за своей высокой патогенности может оказывать значительное экономическое влияние на урожайность различных сельскохозяйственных культур, включая салат и пшеницу. Бактерии рода Burkholderia spp. являются внеклеточными симбионтами насекомых и существенно улучшают рост насекомого хозяина

Rahnella inusitata способны к образованию аутоиндукторов – специальных молекул, обеспечивающих коммуникацию между различными видами бактерий и регулирующих экспрессию генов вирулентности у многих патогенов. Обнаружение данной бактерии в Trypodendron lineatum и личинке может свидетельствовать о возможности взаимодействия представителей кишечной микробиоты с другими патогенами.

Фитопатогенная бактерия Erwinia sp., обнаруженная в личинке усача, свидетельствует о распространении этих бактерий насекомыми-переносчиками и может передаваться с его яйцами.  Дополнительно было установлено наличие неклассифицированных членов Fungi и гриба рода Penicillium, который широко встречается в природе.

С целью видовой идентификации выявленного спектра грибов было проведено секвенирование полученных ампликонов на генетическом анализаторе 3500 Applied Biosystems. В результате молекулярно-генетической идентификации секвенированных последовательностей в генетической базе данных NCBI определено 7 видов грибов, а также 9 видов бактерий, при этом бактерия Erwinia sp. выявлена только в личинке черного усача (вид близкий возбудителям бактериальной водянки и ожога Erwinia spp.).

Выделенная из личинки черного соснового усача бактерия Erwinia sp. свидетельствует о переносе этих бактерий насекомыми. Следует отметить, что бактериальная водянка – хроническое и неизлечимое заболевание у взрослых деревьев, очаги которого могут активизироваться и затухать ежегодно или с перерывом в несколько лет, при этом течение болезни продолжается десятилетиями. А непосредственно на образцах древесины бактерия Erwinia sp. не выявлена. Таким образом, на пораженных деревьях сосны сибирской кедровой бактерии Erwinia sp., которая вызывает бактериальную водянку кедра не обнаружено уже во второй серии генетических исследований образцов древесины сосны сибирской кедровой. Первая серия испытаний проводилась в 2016 году на базе лицензированной лаборатории лесных генетических исследований Красноярского филиала «Рослесозащиты» и, частично, в лаборатории «Рослесозащиты» в Пушкино. Из этого следует, что ранее сделанный вывод о причинах массового усыхания кедровых лесов, в результате бактериоза вызываемого (Erwinia nimipressuralis Carter.), является преждевременным.

В связи с этим необходимо продолжение серии генетических испытаний, увеличение количества образцов древесины и коры для получения более объективных и точных результатов исследований. Ранее сделанный вывод о причинах массового усыхания кедровых лесов в результате бактериоза, вызываемого (Erwinia nimipressuralis Carter.), признать преждевременным и скоропалительным?».