МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ КОММЕРЧЕСКОГО МИЦЕЛИЯ ТРЮФЕЛЕВЫХ ГРИБОВ

Истинные трюфели, грибы рода Tuber sp., представляют собой гипогенные грибы-аскомицеты. Данные грибы играют важную экологическую роль в качестве эктомикоризного партнера для нескольких семейств растений, например, буковых (Fagaceae) и сосновых (Pinaceae)

Выращивание трюфелей является сложным и многостадийным процессом, поскольку их жизненный цикл включает симбиотические отношения с деревьями-хозяевами. Коммерческое выращивание трюфелей зачастую основано на высадке в теплицы колонизированных трюфелями растений, полученных путем инокуляции суспензией аскоспор. Однако существует проблема с методами инокуляции спор, заключающаяся в заражении растений патогенами, вредителями и другими микоризными грибами. Вследствие этого возникают сложности в получении растения с чистой культурой трюфеля. Инокуляция саженцев растений чистым мицелием имеет больше преимуществ, чем инокуляция спорами за счет того, что обеспечивается непрерывное производство эктомикоризных проростков хорошего качества. Также инокуляция чистым мицелием гарантирует более высокую скорость колонизации проростков, чем инокуляция аскоспорами

В России осуществляется продажа мицелия нескольких видов трюфеля для посева. Товарными формами выступают грунт или компост, инокулированный спорами и мицелием, а также мицелий на зерновом субстрате. Ввиду отсутствия доступной технической информации о производстве посевного материала, необязательной сертификации данной продукции и отсутствии признанных государственных методик по оценке содержания трюфеля в коммерческом мицелии, целью работы являлся метагеномный анализ коммерческого мицелия трюфелевых грибов, производимого и распространяемого в России, для выявления в составе мицелия трюфелевых грибов.

Коммерческий мицелий трюфеля был приобретен на крупных российских маркетплейсах в 2021-2022 году. В работе использовали шесть доступных видов трюфелевых грибов, в т.ч. T. aestivum, T. melanosporum, T. brumale, T. uncinatum, T. magnatum и Choiromyces meandriformis. Посевной материал получен от пяти российских производителей. Образцы для секвенирования готовили посредством вскрытия коммерческого мицелия всех производителей, интенсивного перемешивания и разделения образца методом квартования. В качестве контрольной группы было использовано плодовое тело T. macrosporum. Анализ разнообразия эукариот был проведен с помощью метагеномного профилирования по гену 18S рРНК в ООО «БиоСпарк».

Для выделения геномной ДНК из образцов использовали набор FastDNA SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, США). Для метагеномного профилирования проводили амплификацию гипервариабельного ITS2 участка гена 18S рРНК с применением следующих праймеров: прямой NR_5.8S (F) (5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATCTCGATGAAGAACGCAGCG-3’), обратный NR_ITS4 (R) (5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCATCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) в концентрации 5мкМ. Амплификацию проводили в объеме 25 мкл в смеси, содержащей 5 мкл 5x KTN-mix (Евроген, Россия), 2 мкл смесь праймеров, 0,5 мкл 50x SYBR. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США) в режиме реального времени при следующих условиях: первичная денатурация 3мин при 95℃; 35 циклов: денатурация 30с при 95℃, отжиг 30с при 57℃, элонгация 30с при 72℃; заключительная элонгация 5мин при 72℃. Амплификацию ПЦР продукта, полученного на первом этапе, с целью баркодирования библиотек, проводили в объеме 25 мкл в смеси, содержащей те же компоненты, что и в первом этапе. Амплификацию проводили при следующих условиях: первичная денатурация 3мин при 95℃; 7 циклов: денатурация 30с при 95℃, отжиг 30с при 55℃, элонгация 30с при 72℃; заключительная элонгация 5мин при 72℃. Для амплификации использовали индексы, рекомендованные производителем Nextera Index Kit (Illumina, США).

После второго этапа ампликоны очищали с использованием магнитных частиц AMPureXP (KAPABiosystems, США) в соотношении 1:0.7. Очищенные ампликоны, являющиеся готовыми библиотеками, смешивали между собой и доводили до общей концентрации 2 нM. К отобранным 5 мкл смеси добавляли 5 мкл 0.2М NaOH и инкубировали в течении 5мин. К денатурированной ДНК добавляли 990 мкл HTI и 1 мкл 12,5 мМ заранее денатурированного PhyX. Анализ библиотек проводили на секвенаторе нового поколения Illumina MiSeq методом парно-концевого чтения генерацией не менее 10 000 парных прочтений. На каждый образец были использованы реактивы MiSeqReagentKitv2 nano и MiSeqv2 ReagentKit (500 CyclesPE). Полученные данные обрабатывали в программе, написанной с использованием алгоритма QIIME1.9.1. Распределение последовательностей по таксономическим единицам выполняли с использованием базы данных Silva версии 132 и Unite v8, порог классификации 97%. Эксперимент (контрольные закупки и секвенирование) проведен трехкратно.

Эукариотическое сообщество коммерческих образцов состояло из грибов (OTU 90,29±8,33 %) и неописанных таксонов (OTU 9,71±0,1 %). Грибное сообщество представлено 4 филами, в т.ч. Ascomycota (OTU 88,54±9,41 %), Basidiomycota (OTU 1,54±0,29 %), Mortierellomycota (OTU 0,02±0,001 %) и Mucoromycota (0,19±0,01). Таксономический анализ показал, что в посевном материале содержится 31 род грибов (табл. 1). Несмотря на выраженное грибное разнообразие, выявлено, что в коммерческих образцах мицелия, заявленных как трюфель, представителей семейства Tuberaceae не обнаружено.

В плодовом теле T. macrosporum эукариотическое сообщество состояло только из грибов-аскомицетов (табл. 2). В образцах T. macrosporum обнаружены представители 4 родов грибов, в т.ч. Tuber sp. (OTU 99,5± 0,1%), Saccharomyces sp. (OTU 0,32±0,1%), Aspergillus sp. (OTU 0,07±0,05%) и Penicillium sp. (OTU 0,07±0,05%).

Фила Ascomycota представлена 23 родами, в т.ч. Pseudogymnoascus (OTU 55,83±10,7%), Sporothrix sp. (OTU 7,11±3,42 %), Penicillium sp. (OTU 4,73±2,2 %), Candida sp. (OTU 4,57±3,14%), Neofusicoccum sp. (OTU 0,4±0,05%) и др. Грибы Sporothrix sp. известны видами, вызывающими споротрихоз у млекопитающих. Однако большинство видов данного рода обладают низким патогенным потенциалом и имеют важное экологическое значение. Например, в образцах коммерческого мицелия найден Sporothrix guttuliformis, обитающий в почве и участвующий в процессе гниения древесины, растительных остатков и т.п.

Фила Basidiomycota представлена 6 родами, такими как Apiotrichum sp. (OTU 0,89±0,01%), Clitopilus sp. (OTU 0,39±0,04%), Tomentella sp. (OTU 0,09±0,03%), Gymnopilus sp. (OTU 0,08±0,04%), Sistotrema sp. (OTU 0,07±0,01%) и Ruinenia sp. (OTU 0,02±0,01%). Clitopilus sp. считается распространенным сапротрофным родом. Обнаруженный в посевном материале Clitopilus hobsonii может действовать как корневой эндофит, способствующий росту деревьев

В коммерческих образцах мицелия идентифицирован 31 род грибов, не относящихся к представителям истинных (Tuber sp.), либо ложных (Choiromyces sp.) видов трюфелей, тогда как в плодовом теле гриба идентифицировано 7 видов грибов, среди которых обнаружены нуклеотидные последовательности трюфелей видов T. macrosporum, T. glabrum и T. multimaculatum. Таким образом, показано, что в партиях грибов, поступивших на анализ, генетический материал трюфелевых грибов отсутствует, а большинство симбионтных грибов в коммерческих образцах представлены сапрофитными видами.

Выявленное отсутствие трюфелей в составе посевного материала, поставляемого и производимого в России под видом трюфелевых грибов, указывает на наличие коммерческого спроса и отсутствие качественного предложения. Это может быть связано как с первоначальным отсутствием грибов в составе посевного материала, так и высокой степенью гибели мицелия трюфеля при классических схемах распространения, транспортировки и культивирования. Это свидетельствует о необходимости создания новых способов воспроизводства грибов данного рода в условиях законодательных ограничений, особенно ввиду включения трюфелей в Красную книгу России.