АТТЕНУАЦИЯ ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ
АТТЕНУАЦИЯ ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ
Аннотация
В статье представлены результаты исследований по получению аттенуированного штамма вируса оспы коров (ВОК), определена его безвредность и реактогенность на лабораторных животных.
Аттенуация ВОК была проведена в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) и первично-трипсинизированной культуре клеток из тканей почек ягнят (ПЯ). Вначале вирус был пассирован в ХАО РКЭ до 12 пассажей. При пассировании в РКЭ в местах нанесения вируса наблюдалось уплотнение тканей и образование крупных бляшек на ХАО РКЭ, далее с 13-го по 15 пассажи характер образования бляшек менялось, начали появляться единичные бляшки (оспины) и наблюдалось только уплотнение тканей. Далее пассирование вируса проводили в культуре клеток ПЯ до 65 пассажей, где вирус достаточно быстро адаптировался и репродуцировался. Биологическая активность штамма «CowPOX-CAM» ВОК составляла 6,75±0,22 lg ТЦД50/см3. Полученный вирус (65-пассажного уровня) был апатогенным для лабораторных животных, у которых признаки отклонения от физиологической нормы, тканевые реакции, патологические изменения в виде некроза и гнойного воспаления не наблюдались.
На основе анализа полученных результатов полученный в РКЭ и культуре клеток путем пассирования из вирулентного штамма «CowPOX-CAM» ВОК является пригодным для изготовления вакцины, а также безвредной и ареактогенной для кроликов и морских свинок.
1. Введение
Вирус оспы коров (лат. – Variola vaccina; англ. – Cowpox) входит в состав рода Orthopoxvirus, подсемейства Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae и является одной из самых проблемных, контагиозных вирусных болезней характеризующихся лихорадкой, папулезно-пустулезной сыпью на коже и слизистых оболочках. К вирусам оспы коров восприимчивы крупный рогатый скот всех возрастов, лошади, свиньи, верблюды, ослы, обезьяны, кролики, морские свинки, а также человек. Болезнь является наиболее серьезной и широко распространённой во многих странах мира , , .
На сегодняшний день, несмотря на успешное искоренение натуральной оспы, близкородственные ортопоксвирусы представляют опасность, как для животных, так и для человека. Увеличивающееся число случаев заражения людей вирусом оспы коров от грызунов в первую очередь обусловлено повышенным интересом к содержанию грызунов в качестве домашних животных , . Таким образом, наблюдается постоянная циркуляция представителей рода ортопоксвирусов в природных резервуарах, в результате которой не исключена вероятность рекомбинации участков геномов ортопоксвирусов различных видов и, как следствие, появление новых высокопатогенных ортопоксвирусных инфекций человека. Все это обусловливает необходимости постоянного мониторинга новых случаев заражения животных и человека, а также требует детального изучения вновь выявленных вирусных изолятов, с целью предотвращения возникновения новых эпидемий, так как в последние десять лет в научной литературе стали появляться работы, посвященные открытию и изучению свойств новых видов ортопоксвирусов . Но данный вопрос все еще остается актуальной задачей ветеринарной науки.
Исходя из этого, единственным эффективным методом борьбы с возрастающей угрозой ортопоксвирусных инфекций является вакцинопрофилактика. Вследствие этого необходимо разработать высокоэффективные иммунопрофилактические препараты, обладающие высокой имуногенной активностью, низкой реактогенностью и продолжительным действием в отношении ортопоксвирусов. Так как многие противооспенные вакцины, разработанные в мире вызывали побочные осложнения и категорически запрещено использовать у людей имеющим супрессивным иммунитетом . В связи с этим особенно актуальным является разработка наиболее безопасных вакцин против ортопоксвирусов. При этом наиболее распространенная технология для аттенуации вируса является многократные пассирование дикого вируса на культуре клеток различных животных. Многие исследователи утверждают, что аттенуация вируса оспы была достигнута с помощью культивирования вирусов в культурах клеток или тканей и серийных пассировании, чтобы использовать его в качестве вакцины , . В ветеринарной науке понятие аттенуации также тесно связано с одним из важнейших показателей вакцин, безвредностью и реактогенностью, способностью вакцины не вызывать побочных явлений и патологических изменений у вакцинированных животных , , .
Все вышеизложенное определило актуальность и своевременность данного исследования. Поэтому основной целью настоящей работы является получение аттенуированного штамма ВОК, также определение безвредности и реактогенности разработанной, экспериментальной вакцины против оспы коров.
2. Методы и принципы исследования
Штаммы вируса. В качестве объекта исследований использовали следующие эпизоотические и вакцинные штаммы поксвирусов из лаборатории коллекции микроорганизмов Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности МЗ РК (НИИПББ): а) штамм оспакцины «БИЭМГ-51», для сравнительного изучения степени аттенуации с биологической активностью 6,25 lg ТЦД50/см3; б) эпизоотический штамм оспы коров «CowPOX-CAM», для проведения контрольного заражения животных с биологической активностью 4,45 lg ЭИД50/см3.
Биоэтика и животные. В данных исследованиях использовали морских свинок 1,5 мес возраста (12 гол) гладкошерстной породы и кроликов 3 мес возраста, массой тела 2,5-3 кг (12 гол), белокожие, из породы Шиншилла.
Все работы с животными проводились в соответствии с Законом об ответственном обращении с животными (Закон Республики Казахстан от 30 декабря 2021 года № 97-VII ЗРК) и соответствующими руководящими принципами.
Куриные эмбрионы и культура клеток. Для размножения вирусов и получения аттенуированного штамма были использованы 11-12 суточные РКЭ и первично-трипсинизированная культура клеток ПЯ, которую получали из лаборатории клеточной биотехнологии НИИПББ. Инфицированную культуру клеток просматривали под микроскопом в течение инкубационного 3-5 дней. По истечению данного срока замораживали матрасы, где ЦПД составляло 70-90% всего монослоя.
До начала исследования РКЭ овоскопировали с целью определения их развития и инфицировали на хориоаллантоисную оболочку (ХАО) в объеме 0,2 см3, инкубировали при температуре (37±1) °С с относительной влажностью воздуха (55±5)% в течение 7 сут. В качестве контроля заражали 2 эмбриона стерильным физиологическим раствором в таком же объеме. По истечении времени эмбрионы охлаждали при температуре (4±1) °С в течение 12 часов, затем из эмбрионов извлекали ХАО, визуально рассматривали на наличие образования оспенных поражений. Собранный материал затем гомогенизировали, центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для проведения следующего пассажа.
Получение аттенуированного штамма. Для получения аттенуированного штамма проводили длительное пассирование штамма в культуре клеток ПЯ, что приводит к значительному снижению вирулентности с сохранением иммуногенности. Для этого культуру клеток в матрасах (V=25 см3) инфицировали с дозой вируса 0,01 ТЦД50 на клетку приготовленных на поддерживающей среде и выдерживали 1 час при температуре 37°С. Заменяли инокулят на свежую поддерживающую среду, и культивировали при температуре (37±0,5) ºС в течение 3-5 суток. В течение срока инкубации в матрасах заменяли среду при необходимости, ежедневно микроскопировали и вели учет результатов. Чувствительность культур клеток к штаммам ВОК на каждом пассаже оценивали по сроку наступления цитопатогенного действия (ЦПД), интенсивности его развития и титру вируса в момент окончания культивирования. Для проведения очередного пассажа содержимое пробирок, с каждой культурой клеток, инфицированных разведением вируса 10-1, в сроки максимального развития ЦПД (80% и более площади монослоя клеток) замораживали при минус 40°С, размораживали при комнатной температуре, объединяли в отдельную пробирку и полученную суспензию после проверки на стерильность (МПБ, МПА, Сабуро агар, Сабуро бульон), использовали в 10 кратных разведениях для заражения свежей аналогичной культуры клеток. Методика заражения, культивирования, сбора вируса и оценки чувствительности, адаптации культур клеток на следующем и последующих пассажах аналогична методике на предыдущем пассаже.
Безвредность и реактогенность аттенуированного штамма. Для определения безвредности и реактогенности брали лиофилизированную вакцину из штамма «CowPOX-CAM» в количестве 5 ампул, хранившиеся при температуре (4±0,5) ºС. В каждую ампулу вносили стерильный физиологический раствор в объеме, равном объему до высушивания вакцины. После растворения содержимое всех ампул переносили в стерильный стеклянный флакон, тщательно перемешивали и вводили каждому животному, с соблюдением правил асептики, подкожно в область бесшерстного участка подмышечной области 9-ти морским свинкам и 9-ти кроликам, в дозах 0,3 см3/гол и 0,5 см3/гол, соответственно, а контрольным животным (3 гол морские свинки и 3 гол кролики) вводили физиологический раствор. Параллельно был проведен сравнительное испытание опытной серии вакцины из штамма «CowPOX-CAM» 65 пассаж ВОК со штаммом «Биэмг-51» вируса осповакцины на вышеперечисленных лабораторных животных для определения степени аттенуации. С целью осуществления опытных изысканий нами были сформированы три группы животных: животным первой группы вводили штамм «CowPOX-CAM» ВОК (65 пассаж), второй группе штамм «Биэмг-51» вируса осповакцина и третья группа контрольная группа животных.
В течение трое суток у животных обеих групп визуально оценивали образование в местах инъекции типичных вакцинных поражений (розеола, папула, пустула). За подопытными животными вели клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела. За исходную температуру принимали величину последнего результата измерения перед введением препаратов. По результатам проведения исследований животные должны быть живыми и клинически здоровыми.
Определение биологической активности. Биологическую активность вируссодержащих материалов определяли путем титрования их в РКЭ (учет по бляшкам на ХАО, в ЭИД50/см3) и на культуре клеток ПЯ (оценивали по цитопатогенному действию, выражали в ТЦД50/см3). При постановке реакции поставили контроли на качество культуры клеток, токсичность сыворотки и на специфичность цитопатического действия вируса.
Статистический анализ результатов. Статистический анализ был выполнен с использованием программы Graphpad Prism (версия 6.0), для корреляционного анализа температурных данных. С помощью данной программы построили сгруппированную комбинированную диаграмму, где отображается по группам температура тела животных (ºС) и сроки наблюдения за подопытными животными (сут).
3. Основные результаты
Рисунок 1 - Изменение характера образования бляшек в зависимости от пассажного уровня:
а – образование бляшек в РКЭ (6 пассаж); б – уплотнение тканей ХАО (15 пассаж); в – контроль
Таблица 1 - Уровень накопления ВОК штамма «CowPOX-CAM» в ХАО РКЭ
Пассажный уровень | Период культивирования вируса, час | Титр вируса, lg ЭИД50/см3 (Х±m) | Появление и характеристика оспенных бляшек |
7-й пассаж | 128-145 | 3,75±0,25 | Однотипные, серовато-белые оспинки, размером 1,0-1,8 мм, Поражение ХАО 75-80% |
9-й пассаж | 130-144 | 3,75±0,08 | |
11-й пассаж | 128-140 | 4,00±0,14 | |
13-й пассаж | 126-144 | 4,25±0,20 | Мелкозерные серовато-белые оспинки с плотным уплотнением тканей, размером 0,6-0,9 мм, Поражение ХАО 70-75% |
14-й пассаж | 128-140 | 4,50±0,18 | |
15-й пассаж | 128-140 | 4,75±0,20 | Уплотнение тканей без образований бляшек, поражение ХАО 60-70% |
Примечание: n=4
Как видно из представленных данных рисунка 1 и таблице 1, проведение последовательных пассажей (до 15-го пассажа) на куриных эмбрионах привело к восстановлению биологической активности штаммов за период пассажных работ до 4,75±0,20 lg ЭИД50/см3. Начиная с 7 по 11 пассаж с титром вируса 3,75±0,25 lg ЭИД50/см3– 4,00±0,14 lg ЭИД50/см3, соответственно, штамм «CowPOX-CAM» вызывал на ХАО образование крупных бляшек величиной 1,0 – 1,8 мм, с бело-желтоватым оттенком. Данный штамм на 13 и 14 пассажах образовал однотипные, серовато-белые мелкозерные оспинки, размером 0,6-0,9 мм. При последующих пассажах (с 15 пассажа) наблюдалось уплотнение тканей.
Аттенуация вируса в культуре клеток ПЯ. В связи с уменьшением инфекционной активности вируса в РКЭ дальнейшее пассирование (начиная с 16-го пассажа), культивировали в культуре клеток ПЯ. Биологическая активность 16 пассажа в культуре клеток составлял 4,00±0,15 lg ТЦД50/см3. Также вирус накапливался примерно в одинаковой степени, как при начальных пассажах культивирования, так и при последующих до 65-ти пассажных уровнях, поражая 85-90% клеточного монослоя. Время цитопатического действия уменьшалось от 16-го к 65-му пассажу с 96-120 ч до 88-90 час, далее оставалось на том же уровне, также повышение уровня накопления вируса варьировало от 4,00±0,15 до 6,75±0,22 ТЦД50/см3. Следует отметить, что условия культивирования вируса оставался без изменений при температуре (37±0,5)°С. При микроскопировании в инфицированных матрасах наблюдали ЦПД (округления и изменении морфологии клеток), тогда как в контрольных матрасах культура клеток не изменялась, сохраняя нормальную структуру клеток.
Рисунок 2 - Температурная реакция животных на введение вакцинных препаратов:
а – животные первой группы иммунизированные аттенуированным штаммом «CowPOX-CAM» вируса ОК (65 пассаж); б – животные второй группы иммунизированные штаммом «Биэмг-51» вируса осповакцины; в – контрольная группа животных, не иммунизированные
Примечание: нормальный диапазон температуры тела кроликов 3-5 месячного возраста – 38,5-39,5 °С, морских свинок – 38,0-39,5 °С
Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют утверждать, что длительное пассирование вируса на культуре клеток ПЯ позволило получить адаптированного, аттенуированного штамма ВОК и испытуемый нами аттенуированный штамм «CowPOX-CAM» является безвредным и ареактогенным для морских свинок и кроликов.
4. Обсуждение
Связь домашних животных с человеческой популяцией, зоонозный потенциал вируса оспы коров и другие ортопоксвирусные инфекций определяет социально-экономическое значение эпидемий оспы, а, следовательно, и актуальность разработки средств защиты от данного заболевания. Более того, сохраняется опасность повторных возникновений вспышек этих заболеваний в человеческой популяции или его предумышленного применения против людей. Поэтому вакцинопрофилактика животных против ортопоксвирусов является единственным способом защиты людей, животных и птиц.
Впервые в 1931 году ученые Эрнест Гудпастур и Элис Майлз Вудрафф разработали новую методику, при которой куриные яйца использовались для размножения вируса оспы . В наших исследованиях, как и в других, использовали в качестве моделей искусственно инкубированных, 11-12 суточных РКЭ. Проведение последующих пассажей ВОК привело к тому, что характер поражения ХАО изменился к 15-му пассажу. Если в начальных пассажах были четко выраженные, крупные оспенные бляшки серовато-белого цвета, начиная с 15-го пассажа, бляшки уменьшались в размере до плотного уплотнения ХАО, и это обуславливает использовать более доступную систему для культивирования ВОК. Поэтому для решения вышеуказанной задачи нами в последующих экспериментах по получению аттенуированного штамма для изготовления вакцины была выбрана первично-трипсинизированная культура клеток ПЯ, которая не требует дополнительных условий и денежных затрат. Также в истории ветеринарной науки в последнее время широко обсуждается перспектива замены РКЭ как единственного субстрата для выделения и последующего выращивания вирусов и наработки вирусных вакцин на альтернативную, более простую и экономичную клеточную систему культивирования. Использования культур клеток ПЯ в качестве субстрата для подготовки и культивирования ВОК, более того получение аттенуированных оспенных штаммов является доказательством и основной задачей данных исследовании.
Как известно самым важнейшим условием успешного культивирования вирусов является подбор соответствующей чувствительной системы , . Наиболее оптимальной для репродукции вируса оспы коров является культивирование его в первично-трипсинизированной культуре клеток ПЯ , . Нами испытуемые оспенные штаммы в данной клеточной культуре хорошо реплицировались, вызывая цитопатологические изменения в виде «гиперпластических очагов» в монослое клетки. При пассировании штаммы адаптировались в культуре, составляя время культивирования 88-90 ч. В это время, хотя цитопатологическое действие вируса наблюдалось очень быстро и полностью повреждало клеточный монослой в течение вышеуказанных часов, при этом биологическая активность вируса оставалась неизменной.
Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что длительным пассированием вируса на культуре клеток ПЯ достигнуто снижение остаточной вирулентности и получен аттенуированный штамм вируса оспы коров и был условно обозначен под названием «CP-65».
Полученные нами результаты по безопасности и реактогенности превосходят с данными других авторов , , утверждая о том, что указанный штамм обладает всеми свойствами аттенуированности и может найти успешное применение в производстве вакцинных препаратов против оспы коров. В наших исследованиях данный всесторонне испытанный штамм показал себя как безопасным и ареактогенным по отношению к лабораторным животным.
5. Заключение
Получен аттенуированный штамм вируса оспы коров при длительном пассировании вируса в культуре клеток ПЯ. Полученный штамм при подкожном введении мышам, морским свинкам и кроликам демонстрирует аттенуированность, без воспалительно-некротической активности и не вызывает каких-либо побочных эффектов у тестируемых видах животных. Все животные оставались здоровыми и живыми на протяжении всего срока наблюдения.