УСПЕХИ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ КАРТОФЕЛЯ
УСПЕХИ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ КАРТОФЕЛЯ
Аннотация
Эффективность и точность подходов редактирования генома растений совершенствуются с каждым годом, благодаря чему значительно расширяются возможности улучшения различных характеристик сельскохозяйственных культур. Картофель – важнейшая овощная и техническая культура, выращиваемая во всех регионах мира. Картофель является вегетативно размножаемым тетраплоидным видом растений с высокой гетерозиготностью, поэтому успешное применение различных систем геномного редактирования, таких как CRISPR/Cas или TALEN, требует множества усилий, времени и соответствующих методологических подходов. За прошедшие десять лет исследования в области редактирования генов картофеля позволили изменить состав крахмала и улучшить качество клубней, повысить устойчивость растений к фитопатогенам, вирусам, гербицидам и абиотическим стрессам. В данном обзоре кратко рассмотрены основные направления и достижения редактирования генов картофеля.
1. Введение
Картофель (Solanum tuberosum L.) считается важной сельскохозяйственной культурой как в развитых, так и в развивающихся странах. Он широко используется не только для потребления в пищу, но также для промышленной переработки (производство крахмала, спирта и др. фармацевтических субстанций) и рекультивации . Картофель является четвертой сельскохозяйственной культурой по величине валового сбора в мире после кукурузы, риса и пшеницы. Традиционные методы селекции картофеля направлены на повышение урожайности, улучшение пищевой ценности, качества переработки и хранения клубней. Выращивание картофеля сталкивается с рядом проблем, связанных с рядом абиотических стрессов, таких как засуха, засоление, неустойчивая температура, заморозки, эрозия почвы и др. Помимо этого, картофель уязвим примерно к 50-ти различным типам вредителей и болезней, вызываемых вирусами, бактериями, грибами, нематодами и насекомыми, что требует постоянного обновления сортимента . Высокая гетерозиготность и тетраплоидный характер генома картофеля являются немаловажными сдерживающими факторами усилий селекционеров по улучшению картофеля. Для его совершенствования можно использовать не только традиционную селекцию, но и различные биотехнологические подходы, появившиеся в последнее десятилетие, позволяющие ускорить селекционный процесс. К таким подходам относится редактирование генома с помощью различных молекулярно-биологических инструментов, таких как CRISPR/Cas9 системы, а также цинковые пальцы (ZNF) и TALEN нуклеазы . Все они основаны на изменении нуклеотидной последовательности целевых генов на уровне клеток, с дальнейшей регенерацией из них полноценных растений. Обычно генетические конструкции, несущие последовательности редактирования генома, доставляются в растительные клетки путем генетической трансформации с использованием Agrobacterium, бомбардировки частицами и трансфекции протопластов. Подавляющее большинство генетически отредактированных растений (90%) получено путем агробактериальной трансформации . Используя транзиентную экспрессию, можно осуществлять редактирование генома без введения в геном растений последовательностей, кодирующих компоненты систем редактирования ДНК.
Первыми растениями, подвергшимися редактированию генома, были сельскохозяйственные культуры – кукуруза, рис и томат, а также модельные растения – табак и Арабидопсис . Первые растения картофеля с отредактированным геномом были получены десять лет назад в 2014 г. . Исследования показывают, что геномное редактирование у полиплоидных видов растений, к которым относится картофель, менее эффективно, так как для полноценного проявления признака необходимо внести мутации во все аллели. Картофель характеризуется недетерминантным типом развития, что позволяет его легко поддерживать путем вегетативного размножения клубнями или черенками в культуре клеток и тканей in vitro. Однако при неполном редактировании, когда не удается индуцировать мутации у всех гомеологов, гомозиготные мутанты в дальнейшем можно получить только путем скрещивания, что приводит к потере сортовой специфичности. В данном обзоре рассмотрены различные аспекты и достижения редактирования генома картофеля за десять лет применения этой биотехнологии, направленные не только на совершенствование способов геномного редактирования картофеля, но и на улучшение его различных признаков и свойств.
2. Доставка инструментов редактирования генов в клетки картофеля
Для успешного применения любого из существующих инструментов редактирования генов важно доставить его в растительные клетки, способные к регенерации. Чаще всего этого можно достичь путем генетической трансформации различных соматических тканей картофеля, таких как листовые экспланты, стеблевые сегменты или клубневые диски с помощью A. tumefaciens или A. rhizogenes. Также можно использовать ПЭГ- опосредованную трансфекцию или бомбардировку протопластов (Табл. 1). Анализ литературных данных показывает, что в зависимости от используемых методик доставки и ряда сопутствующих условий, эффективность трансформации может отличаться. Например, в исследовании с использованием A. tumefaciens для трансформации листовых и стеблевых эксплантов эффективность варьировала от 0 до 19,2% в зависимости от генотипа, при этом индукция побегов из клеток стебля была лучше, чем из клеток листа. По данным различных литературных источников (Табл. 1), эффективность доставки инструментов геномного редактирования в клетки картофеля при использовании A. rhizogenes – от 7% до 68,8% , тогда как при использовании A. tumefaciens может составлять от 0 до 100% . Другой часто используемый метод – ПЭГ-трансфекция протопластов картофеля – позволяет доставлять генетические конструкции с частотой до 39% . Несмотря на более низкую эффективность, ПЭГ-опосредованная трансфекция позволяет осуществлять временную экспрессию инструментов редактирования генов в виде рибонуклеопротеинов (РНП), транскрибированных in vitro РНК, а также плазмид . Существуют данные о возможности редактирования генов картофеля бомбардировкой и инфильтрацией комплексов РНП, иммобилизованных на микрочастицах хитозана . Благодаря таким методологическим подходам получаемые растения картофеля не являются трансгенными, поскольку не содержат чужеродных вставок вследствие переноса Т-ДНК из A. tumefaciens или A. rhizogenes.
3. Оптимизация методов геномного редактирования картофеля
Первое редактирование генома картофеля осуществлено в 2014 году с использованием системы TALEN. Изменению подвергался ген редуктазы боковой цепи стерола (SSR2), ответственной за синтез растительного холестерина и предшественника токсичных стероидных гликоалкалоидов , при этом данных об эффективности редактирования не было приведено. В 2015 году сразу в нескольких лабораториях было выполнено геномное редактирование различных сортов картофеля с использованием TALEN и CRISPR/Cas9 систем , , , . С этого времени опубликовано более 37-ми работ, посвященных как методологическим аспектам геномного редактирования, так и целевой модификации генов картофеля, имеющей практическое значение (Табл. 1).
Для разработки эффективных протоколов редактирования картофеля в ряде работ использовали гены-мишени, которые позволяют легко обнаружить фенотипические проявлении при наличии мутаций. Так, в нескольких работах были представлены данные об использовании CRISPR/Cas9 и TALEN систем для редактирования гена ацетолактатсинтазы ALS (определяет устойчивость к гербициду) с целью выяснения влияния используемой системы экспрессии на эффективность редактирования генов , , , . В другом исследовании ген ALS использовали в качестве маркера для выявления успешного нокаута 5'-UTR гена Ubi7 картофеля после временной экспрессии инструментов редактирования TALEN для создания растений с сайт-специфически интегрированной Т-ДНК . Помимо гена ALS, для разработки методологии редактирования генома картофеля использовали ген зеленого флуоресцентного белка GFP , ген флаванон-3-гидроксилазы F3H и ген фитоендесатуразы PDS , . Так, нокаут гена PDS приводит к появлению хлорофилл-дефицитных пятен на листьях или растения становятся полностью альбиносными в результате нарушения функциональной активности фермента фитоендесатуразы, катализирующей ключевую стадию биосинтеза каротиноидов. Нокаут GFP в ранее полученных трансгенных растениях, позволил оценить эффективность редактирования за счет изменения флуоресценции клеток . Антоцианы, придающие тканям картофеля красный и фиолетовый цвет, не могут образовываться, если произошел успешный нокаут гена F3H, поэтому изменение окраски цветов и клубней (на белый или желтый) служат характеристикой эффективности геномного редактирования, которые легко заметить и оценить во время выращивания . Несмотря на возможность использования указанных и подобных генов для оптимизации процесса геномного редактировании картофеля, большинство исследователей предпочитает оттачивать методические подходы непосредственно на целевых-генах мишенях, имеющих прикладное или научное значение (Табл. 1). Например, обнаружено, что осмотический стресс может увеличить эффективность редактирования генома картофеля методом CRISPR/Cas9, при этом, целевой модификации подвергался ген Like3, фермент которого участвует в катализе определенных этапов метаболизма глюкозинолатов для защиты растений .
Таблица 1 - Успехи модификации генов картофеля при использовании различных технологий геномного редактирования
Год публикации | Способ доставки и тип экспланта | Система редактирования | Цель генетического редактирования | Ген/ы | Ссылка |
2014 | Трансформация A. tumefaciens клубневых дисков | TALEN | Изменение метаболизма | SSR2 | |
2015 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Методология, изменение метаболизма | IAA2 | |
2015 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Методология | ALS1 | |
2015 | Трансфекция протопластов | TALEN | Качество клубней | VInv | |
2015 | Трансфекция протопластов | TALEN | Методология | ALS | |
2016 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 и TALEN | Методология | ALS1 | |
2016 | Трансформация A. tumefaciens | TALEN | Методология | Ubi7, ALS | |
2017 | Трансфекция протопластов | CRISPR/Cas9 | Методология, качество клубней | GBSS | |
2017 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | TALEN | Методология, качество клубней | vacINV2 SBE1 | |
2017 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Устойчивость к абиотическому стрессу | MYB44 | |
2018 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Методология, качество клубней | GBSS | |
2018 | Трансформация А. rhizogenes | CRISPR/Cas9 | Изменение метаболизма | 16DOX | |
2018 | Трансфекция протопластов | CRISPR/Cas9 | Методология, качество клубней | GBSS | |
2018 | Бомбардировка и вакуумная инфильтрация меристем | CRISPR/Cas9 | Методология | COIL | |
2018 | Бомбардировка и вакуумная инфильтрация меристем | CRISPR/Cas9 | Методология | PDS | |
2019 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | TALEN | Изменение метаболизма, качество клубней | SSR2 | |
2019 | Трансфекция протопластов | CRISPR/Cas9 | Методология, качество клубней | GBSS | |
2019 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Методология | ALS | |
2020 | Трансфекция протопластов | CRISPR/Cas9 | Качество клубней | PPO2 | |
2021 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Методология, качество клубней | PPO1 PPO2 vacINV1 BAM1 | |
2021 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Устойчивость к биотическим стрессам | MLO1 HDS TTM2 DND1 CHL1 DMR6-1 DMR6-2 | |
2022 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Устойчивость к биотическим стрессам | eIF4E | |
2022 | Трансфекция протопластов | CRISPR/Cas9 | Устойчивость к биотическим стрессам | eIF4E | |
2022 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Методология | GFP | |
2022 | Трансформация A. rhizogenes листовых эксплантов и сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Методология | HLH47 | |
2022 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas13 | Устойчивость к биотическим стрессам | PI, HC-Pro, P3, CI1, CI2, VPg | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Устойчивость к биотическим стрессам | NRL1 | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Методология | PDS | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля и листьев | CRISPR/Cas9 | Методология, качество клубней | GBSS | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Методология, качество клубней | GBSS SBE | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Качество клубней | FtsZ1 | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | TALEN | Методология, изменение метаболизма | SSR2 | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens сегментов стебля | CRISPR/Cas9 | Методология, изменение метаболизма | Like3 | |
2023 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Качество клубней | VInv AS1 | |
2024 | Трансфекция протопластов | CRISPR/Cas9 | Методология | F3H | |
2024 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Устойчивость к абиотическим стрессам | DMR6-1 | |
2024 | Трансформация A. tumefaciens листовых эксплантов | CRISPR/Cas9 | Качество клубней | Pain-1 (VInv1) |
В настоящее время большая часть работ, посвященных геномному редактированию картофеля выполнена с использованием системы CRISPR/Cas9 (Табл.1). В 30-ти известных нам работах для индукции мутаций использовали CRISPR/Cas9, тогда как только в 8-ми исследованиях для этого применяли систему TALEN, что является следствием того, что эффективность последней обычно ниже, при этом конструирование TALEN инструментов более трудоемко. Что касается типа экспланта, используемого для получения геномно отредактированных регенерантов картофеля, то листовые и стеблевые сегменты растений in vitro используются в одинаковой мере, часто (Табл.1) в зависимости от предпочтений в той или иной лаборатории. Только в исключительных случаях для этого использовали меристемы , или клубневые диски .
4. Основные направления редактирования генов картофеля
Поскольку основной целью культивирования картофеля является получение клубней, то модификация признаков, так или иначе связанных с клубнями, является одним из главных направлений геномного редактирования. Анализ литературы показывает, что изменению состава крахмала и размера крахмальных гранул, содержанию гликоалкалоидов, а также улучшению ряда послеуборочных признаков, таких как побурение или холодовое пожелтение, уделялось особое внимание (Табл. 1). Целый ряд исследований посвящен редактированию генов, вовлеченных в биосинтез крахмала, в частности гранул связанной синтазы GBSS и крахмал-ветвящего фермента SBE. Так, нокаут генов GBSS в ряде исследований
, , , позволил получить картофель, не содержащий амилозу (разновидность крахмала) в клубнях. Такой картофель, содержащий только разновидность крахмала амилопектин, может найти промышленное применение для производства бумаги, клея, текстиля и биопластиков, а также позволит получать больше этанола без дополнительных затрат. Размер крахмальных зерен имеет значение при переработке и хранении клубней. Показано, что гранулы крахмала меньшего размера разлагаются быстрее, тогда как клубни с большими гранулами крахмала, более подходят для длительного хранения. В работе путем индуцирования мутаций в гене тубулиноподобной ГТФазы FtsZ1, контролирующего деление пластид, из-за нарушения деления и образования «макропластид», были получены растения, содержащие в клубнях крахмальные гранулы большего размера.Поскольку картофель относится к семейству Пасленовых, в большинстве его тканей накапливаются стероидные гликоалкалоиды α-соланин и α-чаконин, которые придают горький вкус и токсичны для человека при больших концентрациях. Одной их групп исследователей удалось снизить в клетках картофеля содержание гликоалкалоидов благодаря нокауту 2-оксоглутарат-зависимой диоксигеназы (16DOX), которая катализирует 16α-гидроксилирование (22S)-22,26-дигидроксихолестерина на более поздней стадии биосинтеза гликоалкалоидов . В другом исследовании уровень токсичных метаболитов (соланин и чаконин) был значительно понижен в клубнях картофеля благодаря нокауту гена редуктазы боковой цепи стерола SSR2 , .
Клубни растений, у которых были внесены мутации в последовательность гена вакуолярной инвертазы (VInv, Pain-1), демонстрировали низкий уровень редуцирующих сахаров, образующихся в результате долговременного холодового хранения, что позволяет снизить потемнение картофельных чипсов во время жарки и понизить содержание в них акриламида , , , . С этой же целью были внесены мутации в ген вакуоляряной амилазы (BAM1), однако данные об улучшении качества клубней пока не были представлены . Недавнее мультиплексное редактирование генов, кодирующих аспарагинсинтетазу 1 (AS1) также продемонстрировало возможность существенно снизить окрашивание картофельных чипсов и содержание акриламида после жарки благодаря значительному уменьшению содержания глюкозы и фруктозы в длительно хранящихся клубнях .
Серьезной проблемой, как для производителей, так и для потребителей картофеля является ферментативное потемнение тканей, которое происходит при разрезании клубней, а также при их повреждении во время сбора урожая, и послеуборочных операций, таких как транспортировка, хранение и сортировка. Сейчас этот нежелательный процесс контролируется на производстве с помощью химических или физических агентов. В настоящий момент опубликованы работы, в которых с помощью системы CRISPR/Cas9 внесли мутации в гены, кодирующие ферменты полифенолоксидазы (PPO1 и PPO2), участвующие в потемнении тканей картофеля . Благодаря индукции нокаутных мутаций во всех четырех аллелях гена PPO2 удалось снизить ферментативное потемнение клубней на 73% .
В работах, направленных на улучшение агрономических свойств растений картофеля, повышение устойчивости к различным абиотическим и биотическим стрессам также является важной темой для исследований. Существует ряд публикаций, в которых различные инструменты редактирования генов использовали для повышения устойчивости растений к вирусам, раннему и позднему фитофторозу картофеля, а также устойчивости к солевому и осмотическому стрессу (Табл. 1).
Вирус Y картофеля (PVY), относящийся к семейству Потивирусов, распространен по всему миру, имеет широкий круг хозяев, включающий культивируемые виды пасленовых и множество сорняков, и является одним из самых вредоносных патогенов картофеля, наносящих серьезный ущерб при возделывании, а также в семеноводческих хозяйствах . Известно, что данный РНК-геномный фитовирус использует для репликации и размножения эукариотический комплекс инициации трансляции клеток хозяина 4F (eIF4F), поэтому индукция мутаций во всех аллелях гена eIF4E, входящего в этот комплекс, позволила предотвратить распространение инфекции и существенно повысить устойчивость растений к штаммам PVYO и PVYNTN
, . Помимо внесения мутаций в гены картофеля, предложена стратегия внесения в геном картофеля СRISPR/Cas13 инструментов, направленных на нокаут нескольких генов вируса Y, что позволило получить трансгенные растения, устойчивые к заражению штаммами PVYN, PVYO, и PVYNTN . Также, было показано, что внесение мутаций в белок коилин, может повысить устойчивость .Фитофтороз – самое серьезное грибное заболевание картофеля во всем мире, вызываемое оомицетом Phytophthora infestans. В одном из исследований функциональный нокаут двух из семи предполагаемых генов чувствительности к патогену StDMR6-1 и StCHL1 привел к уменьшению очагов поражения листьев картофеля фитофторозом . В другом исследовании получены неоднозначные результаты, поскольку мутантные линии с четырехаллельным нокдауном гена StNRL1, демонстрируя повышение устойчивости к P. infestans, оказались восприимчивы к другому патогену, Alternaria alternata .
Что касается исследований связанных с устойчивостью растений картофеля к абиотическому стрессам, то еще в одной из первых работ по геномному редактированию картофеля была предпринята попытка нокаутировать ген транскрипционного фактора MYB44, регулирующего транспорт фосфатов, подавляя экспрессию PHOSPHATE1 в картофеле . В недавней работе, растения картофеля у которых были индуцированы мутации в гене DMR6-1 проявляли большую толерантность к засоленным условиям и поддерживали более высокую скорость роста по сравнению с контрольным генотипом .
5. Заключение
Исследования, связанные с геномным редактированием картофеля, проводятся всего десять лет. За этот короткий срок выявлены и исследованы факторы, влияющие на эффективность геномного редактирования картофеля, а также продемонстрирована возможность получения растений с измененными генами, не несущими вставки последовательностей инструментов геномного редактирования. Уже получены экспериментальные линии картофеля с повышенной устойчивостью к действию биотических и абиотических стрессовых факторов, а также с улучшенными свойствами клубней. С каждым годом растет число новых работ, адресованных методологическим и практическим аспектам применения систем геномного редактирования картофеля. Их дальнейшее развитие открывает широкие перспективы совершенствования картофеля с целью получения высокопродуктивных сортов обладающих востребованными качествами клубней.