ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНОВ КАЗЕИНОВЫХ БЕЛКОВ И ГЕНОВ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА У КОРОВ СИММЕНТАЛЬСКОЙ ПОРОДЫ
ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНОВ КАЗЕИНОВЫХ БЕЛКОВ И ГЕНОВ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА У КОРОВ СИММЕНТАЛЬСКОЙ ПОРОДЫ
Аннотация
В работе представлено исследование генетического разнообразия по генам каппа-казеина (CSN3), бета-казеина (CSN2), 1-ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза и Стерол-CoA десатураза 1 (SCD1) коров симментальской породы. Образцы ушных выщипов для генотипирования были получены из Орловской области. Исследование проводилось с применением методики ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме «реального времени» по разработанным нами и оптимизированным методикам. В результате нами были определены частоты встречаемости аллелей и генотипов исследуемых генов. Отклонение по Харди-Вайнбергу для генов AGPAT6, CSN3 и CSN2 не наблюдалось, в то же время для гена SCD1 выявлено смещение генетического равновесия.
1. Введение
Оценка факторов, влияющих на изменчивость технологических свойств молока, может являться критерием, по которому возможен отбор животных в селекционном процессе. К таким факторам зачастую относят породу, условия кормления, возраст и генотип животного. Влияние технологических свойств на производственные процессы, такие как производство сливочного масла, молочных консервов или выработка сыра зависит от содержания основных компонентов молока – % жира и % белка, соотношения ненасыщенных и насыщенных жирных кислот, термостабильности и способности к сычужному свертыванию , , , . Учёт при подборе животных их генотипов по селекционно-значимым генам позволит создавать стада, производящие молоко с оптимальными для его переработки характеристиками , особенно для симментальской породы, молоко которой по содержанию % жира и % белка является максимально оптимальным для промышленного использования.
Из имеющихся технологических свойств возможно контролировать и улучшать насыщенность жирных кислот, термостабильность и сычужное свертывание с применением маркерной-селекции. Влияние таких генов, как 1-ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза (AGPAT6) и Стерол-CoA десатураза 1 (SCD1) принято ассоциировать с массовой долей жира и его насыщенностью , , , а аллельные полиморфизмы по генам каппа- и бета-казеина с массовой долей белка, и соответственно, с термостабильностью и выходом творога и сыра , , . Таким образом, целью нашей работы было установление генетического разнообразия по генам казеиновых белков – каппа- и бета казеина и генам липидного обмена – AGPAT6 и SCD1 у коров симментальской породы.
2. Методы и принципы исследования
Исследования проводились на животных симментальской породы (n=298) (Орловская область). Геномная ДНК выделялась с использованием набора «ДНК-Экстран-2» производства НПО «СИНТОЛ» из выщипов ушных раковин.
Реакцию амплификации проводили в 15 мкл смеси ПЦР, содержащей 3 мкл реактива qPCRmix-HS («Евроген», Россия), по 3 pМ прямого и обратного праймеров, и аллель-специфичных ДНК-зондов (таблица1) и 10 нг ДНК.
Таблица 1 - Последовательности используемых олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зондов
Каппа-казеин (CSN3) | |
CSN3_F: 5’- AGA GCC CAC CTG AGA TCA AC-3’ CSN3_R: 5’-TCT TGG CTG TTA TTC ATT TTG C-3’ CSN3_B: 5’-FAM-CAA CTG CGG TCT AAA TAC TCT AAG GAG-BHQ1-3’ CSN3_A: 5’-HEX-CAA CTG CAG TCT AAA AAC TCT AAG GAG-BHQ1-3’ | |
Бета-казеин (CSN2) | |
CSN2-f: 5’-CTT TGC CCA GAC ACA GTC TCT AGT-3’ CSN2-r: 5’-GCA CCA CCA CAG GGG TT-3’ CSN2_A1: 5’-FAM-CTG GAC CCA TCC ATA ACA GCC TCC C-BHQ1-3’ CSN2_A2: 5’-HEX-TGG ACC CAT CCC TAA CAG CCT CCC-BHQ1-3’ | |
1-ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза (AGPAT6) | |
AGPAT6-F: 5′-CCA GAA AGG CTG GAG GAG TT-3′ AGPAT6-R: 5′-ATT CCC AGA AGC ACA GTT TAG T T-3′ AGPAT6_G: 5′-FAM-CAA GAA AAT GTG ACG GTA-BHQ1-3′ AGPAT6_T: 5′-HEX-CAA GAA AAT TTG ACG GTA T-BHQ1-3′ | |
Стерол-CoA десатураза 1 (SCD1) | |
SCD1-F: 5'-CCC TTA TGA CAA GAC CAT CAA CC-3' SCD1-R: 5'-GAC GTG GTC TTG CTG TGG ACT-3' SCD1-T: 5'-FAM-CTT ACC CAC AGC TCC CA-BHQ1-3' SCD1-С: 5'-HEX-TAC CCG CAG CTC CC-3-BHQ1 |
ПЦР в «реальном времени» генов проводили с помощью прибора Bio-Rad CFX96 в оптимизированных условиях: для AGPAT6 и SCD1: 37 °C – 5 мин.; 95 °C – 10 мин.; 95 °C – 20 сек., 55 °C – 30 сек., 72 °C 20 сек., 40 циклов, для CSN3 и CSN2: 37 °C – 5 мин.; 94 °C – 5 мин.; 94 °C – 15 сек., 60 °C – 60 сек., 40 циклов. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и HEX. Аллельная дискриминация оценивалась посредством программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.
Описательные статистические параметры (среднее арифметическое, ошибка, стандартное отклонение) вычислялись при помощи пакета «Анализ данных» в среде MSExcel 2013.
3. Основные результаты
По итогам генотипирования были идентифицированы по 3 генотипа каждого из исследуемых генов (таблица 2).
Таблица 2 - Частоты аллелей и генотипов генов SCD1 и AGPAT6 у голштинизированного черно-пестрого скота опытного хозяйства
| Частоты генотипов | Частоты аллелей | χ2 | p-value | |||
SCD1 | TT | TC | CC | T | C | 6,2 | 0,045 |
0,215 | 0,415 | 0,37 | 0,42 | 0,58 | |||
AGPAT6 | GG | GT | TT | G | T | 2,0 | 0,37 |
0,418 | 0,425 | 0,157 | 0,63 | 0,37 | |||
CSN3 | AA | AB | BB | A | B | 2,4 | 0,3 |
0,54 | 0,36 | 0,1 | 0,72 | 0,28 | |||
CSN2 | A1A1 | A1A2 | A2A2 | A1 | A2 | 0,8 | 0,68 |
0,15 | 0,44 | 0,41 | 0,37 | 0,63 |
В рамках исследуемой выборки симментальских коров минимальные частоты встречаемости были выявлены у генотипов ТТ гена SCD1 – 0,215 и AGPAT6 – 0,157, генотипа ВВ гена каппа-казеина – 0,1 и генотипа A1A1 гена бета-казеина. Частоты встречаемости каждого аллеля равномерно распределялись по выборке. Отклонений фактического распределения частот генотипов от теоретического согласно закону Харди-Вайнберга не наблюдалось, кроме гена SCD1, где нами было выявлено смещение равновесия.
Стерол-СоА десатураза 1 является одним из ключевых ферментов, играющих важную роль в синтезе и метаболизме жирных кислот, т.к. отвечает за образование двойной связи между 9 и 10 атомами углерода и превращением средне- и длинноцепочечных жирных кислот в их ненасыщенные аналоги. Ген SCD1, кодирующий соответствующий фермент, располагается на 26 бычьей хромосоме и у него обнаружены SNP в 3´ нетранслируемой области и 5-м экзоне. В исследуемом полиморфизме c.878C>T в 3-м экзоне рядом работ показаны ассоциации аллеля С с такими признаками продуктивности, как массовая доля жира и белка , , а также содержание мононенасыщенных жирных кислот , , . Интерес к исследованию данного гена проявляется, в первую очередь, из-за его влияния на содержание ненасыщенных жирных кислот, что отражается на качестве молочной и мясной продукции, а также снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний . По этой причине исследования полиморфизма SCD1 проводились в основной массе на голштинской , и мясных породах , , а среди отечественных исследователей на голштинской , голштинизированной черно-пестрой и айширской . Согласно вышеуказанным исследованиям, общей особенность данного гена являлась низкая частота встречаемости аллеля Т (0,07 – 0,27) и, соответственно, гомозиготного генотипа ТТ (0,05 – 0,16). В противовес указанным данным, в нашем исследовании по симментальскому скоту частоты встречаемости аллельных вариантов гена SCD1 оказались практически одинаковыми Т – 0,42, С – 0,57, а самым распространенным генотипом – гетерозиготный СТ – 0,415. Выявленное отклонение распределения частот возможно связано с давлением отбора вследствие того, что молоко симментальских коров является оптимальным по соотношению содержания жира и белка для сыроварения и переработки, а SCD1 отвечает за содержание ненасыщенных жирных кислот, влияющих на тягучесть молочного жира. Но данное утверждение требует более детального анализа аллельного полиморфизма SCD1 на взаимосвязь с технологическими свойствами молока.
AGPAT6, располагающийся на 27 бычьей хромосоме, является наиболее экспрессируемой изоформой ферментов семейства 1-ацилглицерин-3-фосфатацилтрансфераз (AGPATs) в молочной железе крупного рогатого скота в период лактации. Принято считать, что он связан с показателем жирномолочности и оказывает существенное влияние на синтез тригицеридов, катализируя присоединения ацильных групп к глицерин-3-фосфату . Также показано, что нокдаун данного гена приводит к существенным изменениям в содержании триглицеридов и размерах липидных капель в молоке , а некоторые SNP в промотерной зоне влияют на его сплайсинг и получение редуцированных форм фермента . Полученные нами результаты показывают о снижении частоты гетерозиготности – 0,425, в пользу увеличения гомозиготного генотипа GG – 0,418 у коров симментальской породы в сравнении с голштинизированной черно-пестрой породой, где преобладал гетерозиготный генотип – 0,51 .
Бета – и каппа-казеины, составляющие основную массу казеиновых белков в молоке, кодируются одноименными генами – CSN2 и CSN3, располагающимися на 6-й бычьей хромосоме. Казеиновые белки, играющие основную роль в коагуляции молока, позволяют оценивать аллельный полиморфизм их генов как влияние на технологические свойства молока и пригодность к сыроварению [5]. В дополнение этому, в последние десятилетия, бета-казеин рассматривается с точки продовольственной безопасности, а именно, влияние А1-изоформы белка как пищевого аллергена . Аллель В гена каппа-казеина, ассоциированная с повышенным содержанием белка в молоке, а также лучшими коагуляционными свойствами молока, имеет низкую частоту встречаемости у голштинской и голштинизированной черно-пестрой породы, как и у отечественных пород, так и иностранной селекции – 0,3, что обеспечивается за счет гетерозиготного генотипа АВ, т.к. гомозиготный генотип ВВ может встречаться не во всех популяциях или с очень низкой частотой – 0,09 . Распределение генотипов CSN3 в симментальской породе в большей степени аналогично голштинской и превалирует А-аллель CSN3 – до 0,72 . Результаты, полученные в нашем исследовании можно считать идентичными, т.к. частота встречаемости аллеля В и генотипа ВВ, составили – 0,28 и 0,1, соответственно.
Ситуация с приоритетным аллелем А2 гена бета-казеина значительно отличается от аллеля В каппа-казеина. Являясь аллелем «дикого типа», а также в результате активного продвижения тренда на «здоровое молоко А2», частота встречаемости данного аллеля (0,6-0,65), а также гомозиготного генотипа А2А2 (0,4) значительно превосходит аллель А1 и генотип А1А1 – 0,3-0,37 и 0,14, соответственно , , . Сопоставимые результаты были получены нами на симментальской породе: А2 – 0,63; А2А2 – 0,41.
Анализ межгенного взаимодействия показал наличие 64 комбинированных генотипа из 81 возможных с частотами встречаемости от 0,4% до 4,8%. Среди казеиновых белков максимальные частоты встречаемости у комбинированных генотипов (CSN3-CSN2) были у ААА1А2-25,9% и ААА2А2-20%, лучшие же генотипы ВВА2А2 и АВА2А2 встречались значительно реже – 5,2% и 14,3%, соответственно. Наиболее распространёнными комбинированными генотипами у генов липидного обмена (AGPAT6-SCD1) являлись GTCT– 20,3%, при этом наилучший вариант генотипа по продуктивности GGCT был вторым по распространенности – 18,3%.
4. Заключение
В рамках данной работы рассмотрено генетическое разнообразие по генам липидного обмена и казеиновым белкам молока у коров симментальской породы. Распределение частот встречаемости для гена SCD1 составило ТТ-0,215, ТС-0,415, СС-0,37; для гена AGPAT6 составило GG-0,418, GT-0,425, TT-0,157; для гена CSN3 составило АА-0,54, АВ-0,36, ВВ-0,1 и для гена CSN2 А1А1-0,15, А1А2-0,44 и А2А2-0,41. Наиболее часто встречаемые генотипы среди генов казеиновых белков были ААА1А2, а среди генов липидного обмена – GTCT.
Использование полученных данных позволит провести дальнейшие исследования по оценке влияния аллелей исследуемых генов на продуктивность и жирнокислотный состав молока с использованием смешанных моделей в рамках методологии BLUP, а также с применением вложенных факторов, в которых генотип будет являться элементом такого фактора.