1. Введение
Современное антропогенное воздействие на лесные и сельскохозяйственные угодья сопровождается масштабным загрязнением окружающей среды токсичными веществами, среди которых особую опасность представляют галогенированные соединения. В частности, широкое промышленное использование трихлорэтилена (ТХЭ) привело к его повсеместному обнаружению в почвах и грунтовых водах. Согласно монографии IARC (2014) [1] это вещество относится к группе 1 по канцерогенности для человека. В научной литературе сообщается о способности ТХЭ вызывать эндокринные нарушения [2]. Данное вещество включено в перечни приоритетных загрязнителей Министерства экологии и окружающей среды Китая, Агентства по охране окружающей среды США (USEPA) и Европейской комиссии [3]. USEPA в 2009 году установило предельно допустимую концентрацию ТХЭ в питьевой воде на уровне 5 мкг/л.
Являясь стойким загрязнителем, ТХЭ представляет прямую угрозу биоразнообразию, поэтому активно разрабатываются методы очистки (ремедиации) загрязнения TХЭ. В отличие от физических методов утилизации, биологическая рекультивация с помощью увеличения количества микроорганизмов-деструкторов [4], [5], [6] имеет ряд преимуществ: стабильный эффект после обработки, низкая энергоемкость и защита окружающей среды.
Метанокисляющие микроорганизмы открывают новую перспективу решения этой проблемы. Метанокисляющие бактерии (метанотрофы), использующие СН4 как единственный источник углерода и энергии, кометаболизируют TХЭ посредством ферментов метанмонооксигеназы (MMO). MMO катализирует трансформации метана в метанол, одновременно обеспечивая ко-метаболическое превращение TХЭ [4]. Этот процесс кометаболизма рассматривается сегодня как один из наиболее перспективных путей биологической утилизации данного поллютанта из окружающей среды, что делает изучение устойчивости метанотрофных сообществ к ТХЭ критически важным. Всё это определяет актуальность проводимых исследований.
Целью настоящего исследования стало изучение метанотрофных консорциумов, выделеннных из почв Черневой тайги, и оценка перспективности их применения в биотехнологиях очистки природных объектов от ТХЭ. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) оценить способность метанотрофных консорциумов окислять ТХЭ;
2) определить изменения в структуре микробных сообществ почв Черневой тайги при внесении ТХЭ.
2. Методы и принципы исследования
Метанокисляющие консорциумы были выделены из образцов почв на минеральной питательной среде «П» [7], разбавленной в пять раз. Содержание метана в газовой фазе составляло 10% по объему, культивирование вели при постоянном перемешивании и 25оС в течение 15–20 сут. Стабильные культуры (динамика роста, микроскопическая картина) были получены после 5–8 последовательных пересевов (5% инокулята). Состав консорциумов был определен методом 16S рРНК профилирования (Illumina) [8].
Для оценки способности консорциумов окислять ТХЭ его вводили в жидкую фазу флаконов со средой П/5 в количестве 20 и 50 ppm и метан в газовую фазу (10%). В ходе инкубации в течение 10 сут оценивали в динамике микробную биомассу (ОП600), содержание СН4 и СО2 в газовой фазе и содержание ТХЭ методом жидкостной хроматографии («Кристалл 5000.2» (Хроматэк, Россия) на колонке ZB-WAXplusTM). Для оценки влияния на активность микробных сообществ почв, ТХЭ вводили в почву в виде водных растворов для достижения концентраций 0, 0,5, 5, 20 и 50 ppm. Содержание метана в газовой фазе составляло 10% по объему. Пробы газа отбирали один раз в неделю из газовой фазы флаконов для измерения концентраций CH4, CO2 [9]. Эксперимент продолжался 54 дня.
Все измерения выполняли не менее чем в трех повторностях. Для каждой выборки считали среднее и стандартное отклонение в программном продукте Excel 2013 (Microsoft Corp.).
3. Результаты и обсуждение
В результате 8–10 последовательных пересевов из почв Черневой тайги были получены устойчивые метанотрофные консорциумы, удельная скорость роста которых составляла 0,20–0,23 ч-1. Для дальнейшей работы были выбраны два метанотрофных консорциума: Т1 из Томской области и Н2-2 из Новосибирской области. Геномный анализ показал, что метанотрофный компонент обеих консорциумов представлен бактериями р. Methylocystis. Сопутствующая микрофлора была представлена в случае консорциума Т1 Hyphomicrobium, Caenimonas, Variovorax, Lysobacter, а консорциума Н2-2 Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Rhodanobacter.
В процессе исследования динамики роста двух консорциумов (рис. 1) было установлено, что наблюдается существенное влияние трихлорэтилена на ростовые характеристики метанокисляющих консорциумов. В контрольных вариантах (без внесения ТХЭ) интенсивность и динамика роста различались. Консорциум H2-2 в варианте с контролем увеличил ОП600 с начальных 0,32 до 0,48 к 7 суткам, с последующей стабилизацией. Консорциум T1 в контроле рос менее интенсивно, достигнув максимальной ОП600 около 0,43 к 7 суткам.
Внесение ТХЭ оказывало ингибирующее действие на рост метанотрофных консорциумов, но степень влияния была различной. Консорциум T1 с внесенным ТХЭ, показал снижение оптической плотности в сравнении с контролем, с минимальным значением около 0,30 к 14 суткам. В то же время консорциум H2-2 продемонстрировала высокую чувствительность к ТХЭ: оптическая плотность снижалась на протяжении всего эксперимента, опускаясь до 0,13 к 21 суткам.
Таким образом, консорциум T1 проявляет более высокую устойчивость к ТХЭ, в то время как консорциум H2-2 оказалась значительно более чувствительным к данному поллютанту. Это различие в реакциях указывает на потенциально разные механизмы детоксикации или резистентности у исследуемых консорциумов.
Влияние ТХЭ на рост метанотрофных консорциумов Т1 и Н2-2
Для более детального изучения морфологических особенностей и, возможно, механизмов, лежащих в основе устойчивости консорциума Т1, нами был применен метод электронной микроскопии, который демонстрирует особенности морфологии клеток метанотрофных бактерий и бактерий-спутников консорциума Т1 в условиях контроля (рис. 2 а, б) и после воздействия трихлорэтилена (ТХЭ) (рис. 2 в-е). Анализ этих изображений позволяет выявить морфологические изменения, связанные с условиями культивирования.
В контрольных образцах (рис. 2 а, б) клетки метанотрофных бактерий, представители рода Methylocystis, выглядят хорошо сформированными. Клетки имеют овальную или палочковидную форму. Клеточная стенка выглядит целостной, без видимых повреждений. Отсутствуют явные признаки стресса или деградации. Размеры клеток соответствуют типичным для метанотрофных бактерий, и наблюдается некоторая вариабельность формы, что характерно для бактериальных культур. На изображении (рис. 2 б) наблюдаются клетки, образующие скопления, что может свидетельствовать об их агрегации или склонности к образованию биопленок.
В вариантах с внесением ТХЭ (рис. 2 в-е) наблюдаются заметные изменения в морфологии клеток. Клетки выглядят менее упорядоченными, их форма часто становится более неправильной, вытянутой или деформированной. Клеточная стенка может выглядеть истонченной или неровной. Клетки демонстрируют большую вариабельность формы и размеров, некоторые выглядят «сплющенными» или уплотненными. Наблюдается меньшая тенденция к образованию плотных скоплений по сравнению с контролем.
Несмотря на присутствие ТХЭ, клетки метанотрофов не проявляют явных признаков деградации. Этот факт может быть обусловлен наличием в консорциуме Т1 бактерий, способных к эффективной деградации трихлорэтилена. Предполагается, что первичную деградацию трихлорэтилена осуществляют представители филумов Bacteroidota и Actinomycetota, далее остаточные количества хлорированных углеводородов могут соокисляться метанотрофными бактериями.
Такие наблюдения позволяют предположить, что метанотрофные бактерии в консорциуме Т1 при воздействии ТХЭ не столько подвергаются прямой деградации, сколько активно адаптируются к стрессовым условиям. Отсутствие явных признаков деградации подтверждает предположение о наличии механизмов резистентности и, возможно, способности к трансформации ТХЭ, которые не приводят к быстрому разрушению клетки.
Микрофотография клеток метанотрофных бактерий совместно с бактериями-спутниками в вариантах с контролем (а, б) и внесением ТХЭ (в, г, д, е)
Геномный анализ показал (рис. 3) существенные различия в реакции микробных сообществ на внесение ТХЭ. Консорциум T1 продемонстрировал значительное снижение обилия доминирующей группы Pseudomonadota и одновременное существенное увеличение относительного количества Actinomycetota и Bacteroidota. Это свидетельствует о перестройке сообщества под воздействием ТХЭ, возможно, связанной с активной адаптацией или ростом устойчивых к поллютанту компонентов. В отличие от него, консорциум H2-2 показал менее выраженное снижение обилия Pseudomonadota и незначительное увеличение Actinomycetota и Bacteroidota. Таким образом, консорциум T1 проявляет более высокую устойчивость к ТХЭ, в то время как консорциум H2-2 оказался значительно более чувствительным к данному поллютанту. Это различие в реакциях указывает на потенциально разные механизмы детоксикации или резистентности у исследуемых консорциумов.
Таксономический состав микробных сообществ метанотрофных консорциумов Т1 и Н2-2 без внесения ТХЭ и с внесением 0,1 мг/л ТХЭ на уровне филума
Методом высокопроизводительного секвенирования установлено, что внесение ТХЭ в черневую почву Новосибирской области приводило к коренной перестройке таксономической структуры прокариотного сообщества (рис. 4). Наблюдалось резкое увеличение представленности филума Bacillota до 43,2 и 50,7% при внесении 20 и 50 мкг/г ТХЭ, тогда как в исходной почве она составляла 1%. Столь значительное увеличение доли Bacillota может быть связано с несколькими факторами. Во-первых, согласно литературным данным, представители этого филума обладают механизмами детоксикации и устойчивости к ТХЭ, что позволяет им не только выживать, но и активно размножаться в присутствии данного поллютанта, получая конкурентное преимущество перед другими группами микроорганизмов [10]. Во-вторых, возможно, что ТХЭ, или продукты его трансформации, служат для них своего рода питательным субстратом, либо стимулируют их рост другими способами. Такая перестройка сообщества, с доминированием одной или нескольких групп, часто наблюдается в ответ на стрессовые воздействия и свидетельствует о снижении общего микробного биоразнообразия и упрощении структуры экосистемы.
Таксономический состав микробных сообществ черневой почвы Н2 с внесением 50 ppm ТХЭ (1), 20 ppm (2) и без внесения поллютанта (3) на уровне семейств (а) и родов (б)
4. Заключение
В настоящей работе впервые проведена комплексная оценка метаболического потенциала метанотрофных консорциумов, выделенных из почв Черневой тайги, в отношении деградации стойкого хлорорганического загрязнителя — трихлорэтилена. Полученные результаты свидетельствуют о наличии у исследованных метанотрофных ассоциаций эффективного ферментативного аппарата для аэробного соокисления ТХЭ. Для установления механизмов этого процесса планируется полногеномный анализ метанотрофных консорциумов с последующими функциональной аннотацией и анализом метаболических путей. Согласно нашей гипотезе, деградационная активность обеспечивается не только за счет широкого субстратного спектра растворимой метанмонооксигеназы, но и вовлечением альтернативных путей окисления через диоксигеназные и алкен-оксигеназные системы (например, генов todC, etnC).
Важным практическим аспектом работы является доказательство способности выделенных консорциумов T1 и Н2-2 расти и утилизировать ТХЭ в диапазоне концентраций 0,1–0,5 ppm, который существенно превышает предельно допустимые уровни для природных объектов. Это указывает на высокую устойчивость микробного сообщества к токсическому воздействию поллютанта и открывает перспективы его применения для биоремедиации загрязнённых территорий в условиях умеренного климата.
Таксономический анализ показал, что метанотрофным компонентом обоих консорциумов являются бактерии рода Methylocystis, что согласуется с их известной ролью в окислении труднодоступных субстратов и подтверждает эколого-физиологическую значимость этой группы в почвах Сибирского региона. При этом межштаммовые различия между изолятами из Томской и Новосибирской областей, вероятно, обусловлены локальными особенностями почвенных условий и требуют дальнейшего изучения на уровне геномных сравнений.
Таким образом, совокупность молекулярно-биологических и физиолого-биохимических данных позволяет заключить, что метанотрофные ассоциации черневых почв обладают выраженным деструктивным потенциалом в отношении трихлорэтилена, и представляют собой ценный ресурс для разработки эффективных стратегий очистки окружающей среды. Дальнейшие исследования должны быть направлены на оптимизацию условий культивирования и оценку интенсивности деградации в натурных моделях, что приблизит внедрение данных консорциумов в реальные технологии биоремедиации.