1. Введение

[1][2][3][4][5][6]

В лабораторных условиях продолжительность эмбрионального развития

[7][8][9][10][11][12][13]

Температура выступает ключевым экзогенным фактором, определяющим эмбриональное развитие рыб. Отклонение температуры инкубации от оптимума закономерно изменяет скорость эмбриогенеза

[14][15][16][17][18][19][3][20][21][22]

Таким образом, целью настоящего исследования является оценить влияния краткосрочного шокового температурного воздействия на выживаемость и скорость эмбрионального развития Nothobranchius guentheri, как представителя сезонных карпозубообразных.

2. Методы и принципы исследования

Изолят

[11]Вода в этих аквариумах заменялась частично (один раз в 2 дня) и полностью (один раз в 7 дней).

В качестве температурного воздействия использовали три субоптимальных температуры (7, 16 и 34 °C) и один оптимальный (24 °C), служивший контролем. Длительность температурного шока составляла 2 часа; данный интервал был выбран на основе предварительных экспериментов, в которых более продолжительное воздействие приводило к гибели большей части икры. Выбор температурных режимов основывался на данных Markofsky & Matias

[17][20]

Икру отбирали из влажного торфа через 7 суток после акклиматизации и начала активного нерестового поведения. Для экспериментов использовались только икринки на морфологической стадии, соответствующей первой диапаузе. Отобранный материал помещали в чашки Петри (диаметром 90 мм, объем раствора 100 мл) с раствором Ямамото (130 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 2,0 мМ CaCl2Missing Mark : sub, 0,2 мМ NaHCO3Missing Mark : sub) при плотности 16 икринок на чашку.

Эксперимент выполняли в трехкратной повторности (n = 16 × 3). Для инкубации при температурах 16 и 34 °C чашки Петри помещали в термостат (Binder 115, Binder GmbH, Германия), при 7 °C — в холодильную камеру (LKexv 1800 Mediline, Liebherr, Австрия). После 2-часовой экспозиции чашки переносили в термостат (Binder 115) с оптимальной температурой (24 °C). Контрольную группу непрерывно инкубировали при оптимальной температуре. Наблюдение за развитием икры (фиксация гибели и условной стадии развития) осуществляли каждые двое суток в течение 32 дней. Фотофиксацию проводили с помощью светового микроскопа Olympus BX53 (Olympus Corp., Япония), оснащенного цифровой камерой ToupCam 16.0 MP. Для получения изображений применяли программное обеспечение ToupView (ToupTek Photonics, Китай). Последующую обработку полученных микрофотографий (коррекцию яркости, контрастности и экспозиции) выполняли в программе Adobe Photoshop 2024 (Adobe Systems, США).

Для количественной оценки влияния температурного шока на эмбриогенез

– диапауза I (DP I) — равномерное покрытие желтка клетками (глубокими клетками и клетками обволакивающего слоя) (рис. 1, а);

– органогенез I (Org I) — формирование оси тела (4–16 сомитов), визуализация мозговых плакод и глазных пузырей (рис. 1, б);

– органогенез II (Org II) — рост тела эмбриона (24–30 сомитов), частичная пигментация сетчатки и тела, дифференцировка трех отделов головного мозга и слуховых капсул, начало кровообращения (рис. 1, в);

– органогенез III (Org III) — рост тела эмбриона при уменьшении желточного мешка, интенсивное кровообращение, формирование плавниковой складки, достижение кончиком хвоста границы головного отдела (рис. 1, г);

– перед выклевом (PreH) — завершение органогенеза, выраженная пигментация сетчатки и тела, значительное уменьшение желточного мешка, кончик хвоста достигает среднего отдела мозга, аналогичная диапаузе III (рис. 1, д, е);

– выклев — личинки непосредственно после выхода из яйцевых оболочек. Следует отметить, что описанные стадии не являются универсальными, а представляют собой концептуальную основу для данных настоящего исследования. Классическая стадийность развития сезонных карпозубообразных дана в работах Wourms

[23][24]

Обработка данных и визуализация результатов производилась с использованием GraphPad Prism v 9.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA) и в среде RStudio v 3.6.0

[25][26][27]

Для оценки влияния кратковременного температурного воздействия на кумулятивную выживаемость эмбрионов применялся метод Каплана-Майера с последующим сравнением кривых выживаемости с помощью теста Мантеля-Кокса. Сравнение доли выживших эмбрионов и долей эмбрионов на конкретных установленных стадиях развития в определенных временных точках (сутки после воздействия, DPE) проводилось с использованием критерия Краскела-Уоллиса с пост-хок тестом Данна, исходя из распределения данных и однородности вариаций (тесты Шапиро-Уилка и Левена). Для сравнения профилей развития доля эмбрионов на конкретных стадиях рассчитывалась исключительно от числа выживших особей на момент наблюдения, принятого за 100%. Это позволило убрать влияние разной смертности в экспериментальных группах на оценку скорости эмбриогенеза.

Для оценки сдвигов в общем профиле развития (сравнение распределения по всем выделенным стадиям развития) в конкретные временные точки использовался критерий Хи-квадрат. Для данного анализа использовались абсолютные значения количества икринок, просуммированные по трем повторностям каждой группы. При этом на ряде временных точек из сравнения исключались стадии развития без эмбрионов.

Для оценки влияния температурного шока на динамику развития икры на протяжении всего эксперимента применялась обобщенная линейная смешанная модель (GLMM) с биномиальным распределением из пакета glmmTMB v. 1.1.14 [28]. В качестве фиксированных факторов в модель были включены «Температура» (7°C, 16°C, 24°C и 34°C), «Время» (0-32 DPE) и их взаимодействие, а в качестве случайного эффекта биологическая повторность. Оценка значимости главных эффектов и их взаимодействия проводилась с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с поправкой Тьюки из пакета car v. 3.1.5 [29].

3. Основные результаты

Кратковременное воздействие низких температур оказало статистически значимое влияние на выживаемость икры

Во всех экспериментальных группах в период с 2 по 8 DPE отмечалась единичная гибель эмбрионов (рис. 1, ж). Сравнение кривых выживаемости Каплана-Мейера выявило статистически значимые различия между выборками (χ2(3) = 13,91, p = 0,003). В частности, при кратковременном действии температуры 7 °C уже на 6-е сутки зафиксировано значимое снижение выживаемости до 56,3% по сравнению с контролем (H(3) = 8,805, p = 0,004; padj = 0,049) (рис. 1, з). В этой группе наблюдался повышенный уровень смертности на протяжении всего эксперимента, которые достоверно отличался от контроля на 32 DPE (H(3) = 9,278, p = 0,002; padj = 0,008) (рис. 1, и). Выживаемость икринок после воздействия температуры 16 °C к концу опыта также оказалась ниже контрольного показателя 56,25% против 81,25% (padj = 0,021). Между остальными исследованными группами статистически значимых различий не обнаружено.

Применение GLMM для оценки влияния температурного шока на динамику развития икры на протяжении эксперимента подтвердило статистически значимое влияние температуры на траектории стадий DPI (χ2(3) = 28,589, p < 0,001), PreH (χ2(3) = 15,724, p = 0,001) и выклева (χ2(3) = 11,884, p = 0,008). Апостериорный анализ показал, что кратковременное понижение температуры замедляет выход из DP I, переход на стадию PreH и выклев. Так, начиная с 21 DPE, доля эмбрионов на стадии PreH при действии температуры 7 °C была значимо ниже, чем в контрольной группе (z = -4,640, padj < 0,001) и температуре 35 °C (z = -4,709, padj < 0,001) (рис. 2, а, г, д). Аналогичная задержка развития была выявлена и для стадии выклева: начиная с 23 DPE икринки при шоковом воздействии температуры 7 °C значимо уступали как контролю (z = -4,912, padj < 0,001), так и эмрионам, подвергшимся действию температуры 35 °C (z = -4,927, padj < 0,001). При этом динамика доли эмбрионов на стадиях OrgI, OrgII и OrgIII не показала статистически значимых различий между температурными группами (во всех случаях χ2(3) < 1,00, p > 0,05).

Анализ динамики выклева показал, что во всех группах, за исключением икринок после кратковрменной дейстувия температуры 7 °C, выклев первых личинок происходил на 14 DPE (рис. 2, е). Послей воздействия температуры 7 °C выклев наблюдался только на 26-е сутки (рис. 2, и), что статистически значимо отличалось от показателей при температурах 24 °C и 34 °C (H(3) = 7,32, p = 0,036; padjMissing Mark : sub = 0,034 и 0,011 соответственно). Несмотря на выраженную тенденцию к снижению доли выклева при 7 °C (65,2% против 89,7% в контроле), статистически значимых различий выявлено не было (H(3) = 5,50, p = 0,134), что может быть связано с высокой дисперсией данных при данном объеме выборки.

Таким образом, температурный шок (особенно 7 °C и 16 °C) значимо снижает общий репродуктивный успех за счет высокой смертности и задержки эмбриогенеза, однако эмбрионы, пережившие шок, сохраняют способность к успешному завершению развития и выклеву.

4. Обсуждение

Результаты проведенного исследования показывают, что наиболее выраженное влияние на эмбриональное развитие

[17][20][21][30]

В то же время кратковременное действие повышенной субоптимальной температуры (34 °C) не оказало статистически значимого влияния на скорость развития и выживаемость эмбрионов. Как и у других рыб, повышение температуры инкубации у карпозубообразных сокращает сроки эмбриогенеза, что ранее отмечено для

[31][30][19][18][32][22][20]

Приведенные выше экспериментальные данные и результаты настоящего исследований можно объяснить эволюционной адаптацией сезонных карпозубообразных, в частности представителей рода

[5][6][2][33]

Особенность полученных результатов являлась гибель эмбрионов в опытных группах преимущественно на начало опыта (2–8 DPE). Ранние стадии эмбриогенеза рыб (периоды дробления и сомитогенеза) обладают повышенной чувствительностью к стрессовым воздействиям, в том числе термическим. Это обусловлено тем, что на данных стадиях развития происходят важные морфогенетические процессы, при этом формирование эффективных гомеостатических механизмов еще не завершено

[14][34][35][36][18][22][37][32]

В рамках текущего исследования не оценивалось постэмбриональное развитие особей, перенесших температурный шок. Известно, что подобные воздействия могут приводить к отсроченным физиологическим изменениям на последующих стадиях. Например, у взрослых особей

[22][39][40][35]

Наряду с вышеизложенным, воздействие кратковременного холодового шока (7 °C) индуцировало выраженную задержку выхода эмбрионов

[18][32][41][30][3]

Несмотря на значимость полученных результатов, настоящее исследование имеет ряд методологических ограничений.

Во-первых, воздействие температурного шока оценивалось исключительно на эмбрионах, находящихся на стадии первой диапаузы (DP I). Поскольку чувствительность к стрессовым факторам может изменяться в процессе онтогенеза, реакция эмбрионов на температурный стресс на более поздних этапах может иметь иную динамику [14], [36].

Во-вторых, дизайн эксперимента охватывал только эмбриональный период, оставляя неизученным вопрос выживаемости и качества личинок после выклева. Дополнительно, небольшой объем выборки на фоне высокой дисперсии траекторий развития и выживаемости ограничил статистическую мощность анализа, в частности, не позволив подтвердить достоверность снижения доли выклева в группе 7 °C. Ко всему прочему, результаты данного исследования могут быть использованы при содержании лабораторной культуры рыб рода

5. Заключение

1. Кратковременный тепловой шок при 34 °C на стадии первой диапаузы не влияет на динамику развития и выживаемость икры, что отражает высокую эволюционную адаптацию эмбрионов

2. Температурный шок при 7 °C и 16 °C приводит к существенному снижению выживаемости эмбрионов (до 49,7–56,3% к концу эксперимента), при этом основная гибель наблюдается в ранний период — со 2-х по 8-е сутки после стрессового воздействия.

3. Холодовой стресс (7 °C) вызывает выраженную задержку развития за счет удлинения стадии первой диапаузы. Это приводит к смещению начала выклева жизнеспособных личинок с 14-х на 26-е сутки после воздействия.

4. Несмотря на высокую смертность и задержку сроков развития при низких температурах, температурный шок не индуцирует видимых морфологических аномалий у

The additional file for this article can be found as follows: