1. Введение

Активная интенсификация производства свинины и увеличение темпов роста предприятий в конечном итоге приводят к необходимости модернизации различных этапов цепочки производственных процессов за счет внедрения более современных подходов к решению поставленных задач. В последнее время одной из наиболее значимых перспектив для развития свиноводства является освоение методов учёта и контроля генетического фактора.

Современные методы селекции животных не ограничиваются отбором и подбором только взрослого поголовья. Геномная селекция получила широкое признание как инструмент генетического контроля, позволяющий выявлять высокопродуктивных животных в раннем возрасте, а также эффективно предупреждать о наличиях или предрасположенности к различным наследственным заболеваниям. Оценка и дальнейшее использование генетического потенциала свиней с помощью современных подходов для повышения эффективности и устойчивости производства играет крайне важную роль в развитии отрасли [1].

Метод полногеномного поиска ассоциаций (GWAS) нашёл применение во многих передовых биологических исследованиях и является современным подходом в генетике, представляющим собой совокупность статистических приёмов, направленных на выявление взаимосвязи генетических полиморфизмов с различными хозяйственно-полезными признаками. Благодаря повышению доступности технологий генотипирования, использование SNP-чипов высокой плотности в различных исследованиях по всему миру считается общепринятым методом получения информации о генотипе животных. Выполняемый на основе SNP-генотипирования поиск значимых полиморфизмов и аннотация найденных генов позволяет создавать универсальные таргетные генетические панели, обеспечивающие быстрый и недорогой способ ранней селекции [2].

В нашем исследовании целью работы являлось проведение полногеномного поиска ассоциаций (GWAS), основанного на результатах генетических оценок животных, полученных методом наилучшего линейного несмещенного прогноза (BLUP) с последующей функциональной аннотацией генов, достоверно взаимосвязанных с изменчивостью исследованных признаков, по биологическим функциям.

Новизна исследований заключается в выявлении методом GWA-анализа генов, достоверно ассоциированных с оценками племенной ценности животных, полученными на основе BLUP Animal Model, по признакам конверсии корма, среднесуточного прироста и прогнозируемого остаточного потребления корма, для последующей разработки и апробации геномной селекции у свиней породы дюрок.

2. Методы и принципы исследования

Материалом исследования являлись данные первичного учёта признаков кормового поведения 1417 хряков породы дюрок 2017-2020 годов рождения, являвшихся потомками 120 хряков и 499 свиноматок и проходивших откорм на автоматизированных кормовых станциях.

Анализировались следующие признаки: конверсия корма (FCR, кг/кг), среднесуточный прирост (ADG, г), прогнозируемое остаточное потребление корма (RFI, г/сут.), среднесуточное потребление корма (ADFI, г), число посещений кормовой станции в сутки (NVD, шт.), среднее время посещения кормовой станции (TPV, мин.), среднее время, проведенное на кормовой станции в сутки (TPD, мин.), скорость потребления корма (FR, г/мин.), среднее количество корма, потребленного за посещение (FPV, г).

По данным показателям проведен расчет оценок племенной ценности методом BLUP Animal Model. Сформированная модель в линейной форме имела вид:

где y – наблюдаемое значение исследуемого признака, [LATEX_FORMULA]\mu[/LATEX_FORMULA] – популяционная константа, YM – эффект «Год-месяц рождения животного», DFSM – эффект «Дата постановки-возраст в неделях-кормовая станция», party – эффект номера партии, period – эффект продолжительности откорма, BW0 – эффект живой массы в при постановке на откорм, b1-b2 – коэффициенты линейной регрессии компонентов ковариации оцениваемого признака, a – случайный эффект животного (оценка племенной ценности), e – эффект неучтенных в модели факторов (остаток модели).

Было проведено полногеномное ассоциативное исследование трёх признаков, являющихся главными критериями отбора племенных животных в ООО «СГЦ Топ Ген». Анализу были подвергнуты показатели 100 лучших и 100 худших особей, отсортированных по исследованным признакам в соответствии с предпочтительным с селекционной точки зрения направлением селекции (FCR-ADG-RFI). GWA-анализ проводили на основе данных генотипирования, полученных с применением ДНК-чипа Porcine GGP HD (платформа GeneSeek Genomic Profiler, «Neogene», США), содержащим ~70 тыс. SNP. Контроль качества и фильтрацию данных генотипирования для каждого SNP и каждого образца выполняли с использованием программного пакета PLINK 1.9 (http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/), применяя следующие фильтры:

1. Call-rate по всем исследуемым SNP для индивидуального образца не ниже 90% (--mind 0.10).

2. Call-rate для каждого из исследованных SNP по всем генотипированным образцам не ниже 90% (--geno 0.10).

3. Частота встречаемости минорных аллелей (MAF) ≥0,05 (--maf 0.05).

4. Отклонение генотипов по SNP от распределения по Харди-Вайнбергу в совокупности протестированных образцов не выше 0,001 (--hwe 1e-3).

По итогу фильтрации данных, для проведения анализа ассоциаций были отобраны 40549 SNP.

Для выявления ассоциаций SNP-маркеров с изучаемыми признаками применяли регрессионный анализ, реализованный в PLINK 1.90 (--assoc --adjust --qt-means). Для подтверждения достоверного влияния SNP и определения значимых регионов в геноме свиней использовали тест для множественной проверки нулевых гипотез по Бонферрони при пороговом значении p <1,23×10-5 (0,05/40549). Данные визуализировали при помощи пакета qqman версии 0.1.9, реализованного в рамках языка программирования R.

Для поиска генов-кандидатов, локализованных в области идентифицированных SNP, использовали геномный ресурс Sscrofa11.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000003025.6). Функциональные аннотации генов выполняли с привлечением базы данных DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp) и Pig QTL Database (https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index).

3. Результаты

Для достижения поставленной цели исследований одной из задач являлось изучение эффективности использования корма и особенностей кормового поведения в популяции хрячков породы дюрок (n=1417). Как показано в таблице 1, постановку животных на выращивание на кормовых станциях осуществляли в возрасте 79 дней со средней начальной живой массой (BW1), равной 37,1 кг. Средний возраст животных при завершении выращивания составил 153 дня, конечная живая масса (BW2) – 110,1 кг. Среднесуточный прирост животных в течение периода тестирования составил 0,993 кг, что, с одной стороны, свидетельствует о высоком генетическом потенциале продуктивности хрячков, а с другой стороны – указывает на хорошую адаптацию животных к выращиванию в условиях автоматических кормовых станций. Уровни среднесуточных приростов, наблюдаемые нами в выборке хрячков породы дюрок, соответствуют результатам, полученным зарубежными авторами при проведении аналогичных исследований [3].

Уровень конверсии корма (FCR) хрячками в течение периода тестирования варьировал от 1,96 до 3,9 кг/кг и в среднем составил 2,45 кг/кг при среднесуточном потреблении корма 5,41 кг, что согласуется с результатами исследований других авторов [3], [4]. В целом, следует отметить умеренный уровень вариабельности среднесуточных приростов (Cv = 13,0%), показателей эффективности использования корма ADFI (Cv = 14,0%) и FCR (Cv = 10,1%), что, по всей видимости, является следствием высокого селекционного давления при отборе хрячков по вышеназванным показателям.

При ранжировании выборки по показателям ADG и RFI, популяция была разделена на 4 контрастных группы (табл. 4). Из них только две группы, I и IV, характеризуются совокупностью значений, предпочтительных с практической точки зрения. Так хряки, относящиеся к I и IV группам, в среднем, имеют наивысшие показатели кормового поведения и продуктивности, и сравнительно низкий показатель конверсии корма – 2,15 кг/кг и 2,32 кг/кг соответственно. Как следствие, среднесуточный прирост, превышающий среднее по изучаемой популяции, при среднесуточном потреблении корма ниже среднего по популяции, характеризует особей, составляющих эти группы, как наиболее рентабельных в производстве, делая их предпочтительными для использования в товарных и племенных хозяйствах. Подобный вывод также был сделан в раннем исследовании А. А. Сермягина с соавтор. (2022) на хряках породы дюрок [5].

Нами был проведен расчет генетических оценок (EBV) по изучаемым показателям. Учитывая, что основными показателями, определяющим эффективность промышленного производства свинины, является конверсия корма, среднесуточный прирост и прогнозируемое остаточное потребление корма, исследуемые нами хрячки были ранжированы на основании значений EBV по признакам FCR, ADG и RFI. Были выбраны 15 лучших (с наименьшими значениями EBV) и 15 худших животных (с наибольшими значениями EBV) по признаку FCR (табл. 3).

Как показал анализ данных, представленных в таблице 3, группы «лучших» и «худших» хрячков по показателю конверсии корма заметно различались по племенной ценности, рассчитанной для показателей кормового поведения. Хрячки, обладающие лучшей конверсией корма, имели отрицательные генетические оценки по показателям времени нахождения на кормовой станции, количества посещений кормовой станции в сутки и продолжительности одного посещения по сравнению с хрячками, характеризовавшимися худшей конверсией корма, которые, напротив, имели положительные оценки племенной ценности по вышеназванным показателям. С другой стороны, хрячки с лучшей конверсией корма характеризовались положительными оценками племенной ценности по показателям количества потребленного корма за одно посещение и скорости поедания корма по сравнению с хрячками, обладавшими худшей конверсией, которые проявляли отрицательные значения EBV по данным показателям. Стоит отметить, что мы не наблюдали существенных различий в генетических оценках по показателю среднесуточного потребления корма между изучаемыми группами хрячков: как в группе «лучших», так и «худших» хрячков по показателю конверсии корма были выявлены отрицательные генетические оценки для показателя среднесуточного потребления корма, при этом более высокими значениями данного показателя характеризовались хрячки, обладающие более низкой конверсией корма.

Анализ оценок племенной ценности показал значительную вариабельность для основных трех показателей, в связи с чем, дальнейшее исследование направлено на «вычленение» генетической составляющей признаков и поиск генов-кандидатов, ассоциированных с конверсией корма, среднесуточным приростом и прогнозируемым остаточным потреблением корма.

Полногеномное ассоциативное исследование проводили по оценкам племенной ценности показателей среднесуточного прироста, конверсии корма и прогнозируемого остаточного потребления корма, анализируя 100 лучших и 100 худших свиней, так называемых, контрастных животных (рис. 1).

Всего было выявлено 23 SNP по всем представленным признакам, из которых 7 обнаружено у конверсии корма, 6 – у среднесуточного прироста и 10 – у прогнозируемого остаточного потребления корма, расположенных на 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13 и 17 хромосомах. По показателю RFI наибольшая достоверность выявлена у WU_10.2_17_60711306 и ASGA0077744 SNP – Р = 2.20 х 10-5 на 17 хромосоме. По конверсии корма – SNP H3GA0052936, при Р = 1.47 х 10-6 на 10 хромосоме. И по среднесуточному приросту наибольшая достоверность обнаружена у SNP ALGA0115532, при Р = 2.59 х 10-5.

Структурная аннотация показала наличие 55 генов, расположенных на 8 из 18 хромосом по трем изучаемым признакам. Наибольшее количество генов выявлено по прогнозируемому остаточному потреблению корма – 32 гена, по конверсии корма – 14 генов и по среднесуточному приросту – 9 генов.

Следующим этапом работы было функциональная аннотация генов по базе DAVID и Pig QTL Database. Для достоверности полученных результатов, отобраны гены, по которым присутствует биологическое описание в обоих базах (табл. 4).

Так, ген Бестропин 1 (BEST1), ранее выявленный в исследованиях, проводимых Kogelman L. J. с соавт. [6], на помесных гибридах F2 (йоркшир x дюрок), оказывает влияние на отложение и количество белой жировой ткани в организме свиней. В контексте направления продуктивности породы дюрок, это предполагает необходимость определения аллельных замен, позволяющих снизить процентное содержание жира в тушах и увеличить выход постного мяса. Данный ген, согласно работам A. A. Johnson с соавт. [7], экспрессируется преимущественно в глазах и других частях центральной нервной системы и представляет собой интегральный мембранный белок, регулирующий функцию Ca2+ – Cl активируемых ионных каналов.

Ген FADS2 (Десатураза жирных кислот 2), является мембраносвязанным белком, основными функциями которого являются осуществление липидного обмена и превращение линолевой кислоты в гамма-линоленовую кислоту. Вместе с двумя другими ферментами ген FADS2 отвечает за биосинтез арахидоновой кислоты [8] и оказывает влияние на содержание в мясе ненасыщенных жирных кислот, толщину подкожного и внутримышечного жира [9].

В работах G. Catillo с соавт. (2020), было установлено, что ген CRB1 связан с синтезом эйкозатриеновой кислоты, являющейся важной частью биосинтеза незаменимых полиненасыщенных жирных кислот и оказывающей влияние на технологические свойства мяса, в организме. Он также воздействует на восстановительные свойства организма, агрегацию тромбоцитов, ремоделирование кровеносных сосудов, поддержание функционального состояния фоторецепторных клеток глаза [10].

PLCB4 (Фосфолипаза С бета 4) имеет высокий уровень экспрессии во всех мышечных тканях организма, а также мозжечке. В ряде исследований установлена достоверная связь этого гена с показателем среднесуточного прироста (ADG) у свиней, что напрямую указывает на его высокое значение для практического применения в рамках отрасли, основным направлением которой является получение наибольшего количества продукции в кратчайшие сроки [11], [13]. Согласно базе данных DAVID, ген PLCB4 оказывает широкий спектр влияния на организм, в том числе на катаболические и метаболические процессы липидов, что является важным аспектом жизнедеятельности товарных свиней [12].

Все обнаруженные гены, так или иначе, тесно связаны с технологическим свойствами мяса и физиологическими функциями свиней, что при дальнейшей работе с ними может помочь с определением более предпочтительного генотипа животных для производства свинины. Это позволит получать продукты более высокого качества и уменьшить стрессовое воздействие светового фактора на них, за счет влияния некоторых генов на работу нервной системы.

4. Заключение

Использование метода GWAS на контрастных по оценкам племенной ценности выборках животных позволит эффективно прогнозировать значимо взаимосвязанные с изменчивостью хозяйственно-полезных признаков полиморфизмы у свиней породы дюрок. Это приобретает особую важность в контексте возможности разработки тест-систем для раннего выявления желательных генотипов у молодых животных до принципиальной возможности оценки их племенной ценности по собственной продуктивности.

В ходе исследования на 1417 головах хряков породы дюрок были получены следующие результаты:

1. На основе BLUP-оценок племенной ценности определена генетическая структура трёх экономически важных показателей, используемых в отрасли свиноводства: конверсии корма, среднесуточного прироста и остаточного потребления корма.

2. Выявлено и охарактеризовано 4 гена, значимо взаимосвязанных с технологическими свойствами свинины и физиологическими процессами в организме.

3.  Определена целесообразность разработки тест-системы для гена CRB1, связанная с локализацией в его структуре выявленного в ходе данной работы SNP-маркера. Рекомендуется проводить анализ животных в совокупности с другими генами, связанных с мясной продуктивностью свиней: IGF2, MC4R, PRKAG3, RYR1, HMGA1, SCD и POU1F1.

The additional file for this article can be found as follows: